酶工程酶分子定向进化PPT讲稿
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酶工程_第10次_7章
或选择) 技术, 获得具有某些预期特征的改构酶。
Enzyme molecular directed evolution (or enzyme directed evolution)是模拟自然进化过程
（随机突变和自然选择），在体外进行酶向选择得到具有优良催化特性的
选择过程中设定不同的环境条件。 例如： 在较高温度的培养条件下培养重组细胞以提高酶的热稳定 性；
在含有一定浓度的β-内酰胺类抗生素的培养基中培养重组
细胞获得具有抗生素耐受性的酶。
（二）高通量筛选技术
1.平板筛选法
平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况 、颜色变化情况、透明圈情况。
酶的突变体的技术过程。
酶分子定向进化的基本过程主要包括酶分子基因
的随机突变和突变基因的定向选择。
酶定向进化的基本过程
酶基因 随机基因
酶定向进化的基本过程
Section 1 酶基因的体外随机突变
酶定向进化的常用方法
一、易错PCR技术(Error-prone PCR)：在PCR技术
突变。
在通常情况下,经一轮的易错PCR、定向筛选,很难获得 令人满意的结果。所以由此发展出了连续易错PCR,该方法 是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增
的模板,连续反复进行随机诱变,使得每一次获得的少量突变
累积而产生重要的有益突变。
Chen.K和Arnold在 1993年采用易错PCR对该枯草杆
PCR,最终获得发生改组的基因库。
该技术加速积累有益突变,同时实现目的蛋白多种特性的
共进化，在理论上优于连续易错PCR。Stemmer运用DNA shuffling技术对β-内酰胺酶进行了定向进化。他们从对头孢 类抗生素具有较弱抗性的β-内酰胺酶基因出发,经随机突变、 DNA改组和定向筛选,得到上百个对头孢类抗生素抗性较大 的克隆,以这些克隆携带的酶基因作为下一步DNA改组的起 始基因库,经3个循环的改组和筛选,最终获得了一个使宿主细
2011酶工程 第八章 酶的定向进化
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
2） 依据颜色变化筛选
颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝 基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的 黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色 底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没 有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一 个有色化合物。
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂
2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
酶工程5 第八章_酶定向进化
1992年Gram H．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR 向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
最新酶分子定向进化
酶分子定向进化
• 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程 （随机突变和自然选择），在体外 得到具有优良催化特征的酶的突变体的技 术过程。
酶定向进化的基本过程• 随机突变、构建突变基因、定向选择 • 酶定向进化的基本过程：
• 2）随机引物体外重组技术
• 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板 不同部分的序列互补DNA小片断，然后除 去模板，这些DNA小片断互为模板和引物 进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获 得全长突变基因。
三基因家族重排技术
• 概念
• 又称为基因家族改组技术，是从基因家族 的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
• 载体的选择 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链
DNA分子。 2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具
有自我复制能力的载体。 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性
末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单
链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因 载体。
• 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件， 增加碱基配对错误的出现频率，就成为易 错PCR技术。
• 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度 的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、 dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使 DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基 配对错误的出现频率，而引起基因突变。
•
酶定向进化的特点
1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著
第二节 酶基因的随机突变
酶工程说精品PPT课件
3.4解决办法:
基于以上重点及难点，我们从教学模式、策略、手段和 方法等多方面着手寻求解决方法，在减少课内学时的同时 ，仍然能保证良好的教学效果。例如：对于 “ 各种酶分 离纯化技术及组合 ” 的难点问题，可以采用分组收集资 料、讨论等形式，按照分离纯化技术的特点分成若干专题 小组，各小组从课内外收集相关原理、规律进行主题研究 。让学生学会发现问题、提出问题和解决问题。然后在专 题研讨和交流的基础上，教师通过启发式教学，帮助学生 总结提炼共性方面的知识，通过知识的再加工使学生对抽 象原理的领悟更为透彻；
1.酶的分子修饰 (4 学时 ) ； 2.固定化技术 (3-4 学时 ) ； 3.酶的非水相催化 (2-3 学时 ) ； 4.酶反应器 (2 学时 ) ； 5.酶与现代食品工业 (2-3 学时 ) ； 6.酶与医药工业 (2-3 学时 ) ； 7.酶与绿色化工制造工业 (2-3 学时 ) ； 8.酶与环境保护 (2 学时 ) 。
教学考核
10%
平时成绩：
到课率，课堂表 现，学生遵守纪律 以及上课积极参与 情况。
30%
过程性考核：
操作熟练程度、 团队协作能力、吃 苦耐劳精神等。
60%
期末考试：
理论加技能综合 水平的考核。（理 论：技能=1：1）
6.教学条件
6.1教学团队—软件条件 近5年来，全系教师获地厅级以上科研成果奖 30余项，其中省级一等奖5项，二等奖10项，三 等奖25项，获省教育厅教改教学成果奖7项；通 过省级科研成果鉴定20项，省级教学成果鉴定10 项。全系教师在全国CN刊物上发表论文120余篇 ，其中核心期刊50余篇，英文期刊1篇，SCI1篇 ；参编出版论著、教材50余部。
4.教学实施
4.1教学模式
最新第九章-分子定向进化ppt课件
费力、费时，且易出现同型碱基转换
2、 DNA shuffling
1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试 验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一
长 的 时 间 隧 道，袅
第九章-分子定向进化
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋 白编码基因内,通过噬菌体表面展示技 术可方便地筛选出重组子。
不足之处: (1)对19种氨基酸须分别设 计各自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大 肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因 突变修复而难以筛选出突变子; (3)不 适合多点饱和突变。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长
2、 DNA shuffling
1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试 验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一
长 的 时 间 隧 道，袅
第九章-分子定向进化
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋 白编码基因内,通过噬菌体表面展示技 术可方便地筛选出重组子。
不足之处: (1)对19种氨基酸须分别设 计各自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大 肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因 突变修复而难以筛选出突变子; (3)不 适合多点饱和突变。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长
《酶的定向进化》课件
蛋白酶的定向进化
总结词
通过定向进化技术，优化了蛋白酶的特异性，使其能够更有效地水解特定底物， 从而提高目标产物的产量和纯度。
详细描述
在蛋白酶定向进化过程中，通过合理设计突变位点和选择压力，成功获得了具有 更高特异性的突变体。这些突变体能够更准确地识别和切割底物，避免了副反应 的发生，提高了目标产物的产量和纯度。
员。
03
酶定向进化的实例
脂肪酶的定向进化
总结词
通过定向进化技术，成功提高了脂肪酶的耐热性和稳定性，使其在高温和酸碱 条件下仍能保持较高的活性。
详细描述
在脂肪酶定向进化过程中，通过随机突变和选择压力的方法，成功筛选出具有 更高活性和稳定性的突变体。这些突变体在高温和酸碱条件下表现出更高的酶 活性，有助于提高工业生产效率和降低能耗。
未来通过酶定向进化技术，有望进一 步提高酶的性能，满足人类生产和生 活需求。
05
总结与展望
研究成果总结
01
酶的定向进化技术已经取得了 显著的成果，成功应用于多个 领域，如生物制药、环保和能 源等。
02
通过定向进化技术，酶的活性 和选择性得到了显著提高，为 解决一些重要的工业催化问题 提供了有效途径。
03
酶的定向进化技术还为酶的结 构与功能关系研究提供了更深 入的认识，有助于进一步优化 酶的性能。
研究方法总结
酶的定向进化技术主要采用高通量筛选、DNA改组和合理设计等方法，这些方法在 不断发展和完善中。
高通量筛选能够快速发现具有优良性能的突变酶，是定向进化实验中的关键环节。
DNA改组技术通过引入大范围的基因重组，创造更丰富的突变库，有助于发现具有 更高性能的突变酶。
《酶的定向进化》 PPT课件
第七章 酶分子定向进化(1)
定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶 不具有3’→5’校对功能的性质，配合适当条件，以很 低化酶(或蛋白 质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。突变基因的构建质量要求：包容性、完整性
过程：选择合适的载体 （质粒、噬菌体、黏粒、噬菌粒）
基因重组 （DNA连接酶连接突噬菌体）
突变基因的筛选
根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件
高通量筛选技术 特点：通量大、效率高 （短时间内简便地对大量突变进行判断） 方法：平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 细胞表面展示法 核糖体表面展示法
基因家族重排
定义：又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若 干同源基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段， 经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新 排布而引起基因突变的技术过程。
原理：与DNA重排相同，过程亦相同。
区别：DNA重排从通过易错PCR等技术获得两个以上正 突变基因出发进行重排；基因家族重排从基因家族中 若干同源基因出发进行重排。
外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各 自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自 然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子 的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外 显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不 受任何限制，发生在整个基因片段上。
2、通常，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。另有 一些直观的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利 用绿色荧光蛋白的荧光性质等。
3、选择合适高通量的筛选体系。
三、酶分子定向进化的应用
第八章酶的定向进化
二、DNA改组技术
• 在酶分子无性进化策略中，一个具有正向突变的基因在下 一轮易错PCR过程中继续引入的突变是随机的，而这些后 引入的突变仍然是正向突变的概率是很小的。因此人们开 发出DNA改组等基因重组策略．将已经获得的存在于不同 基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。
DNA改组(DNA shuffling)
• 该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的蛋白多种特 性的共进化, 所以无论在理论上, 还是在实际应用中, 均优于连 续易错PCR。
DNA 改组 原理
实例
• β-内酰胺酶是一种水解头孢类抗生素的微生物酶, Stemmer] 等运用DNA shuffling技术对β-内酰胺酶进行改造，每次循环 后从中筛选出数百个酶活力提高的突变体DNA序列用于下次 循环。经过3次循环获得一个赋予宿主细胞对头孢菌素抗性提 高16000倍的突变体。
• 目前已利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化效率、抗氧 化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、 改进酶的别构效应等进行了成功的改造。
酶的合理设计
定点突变的缺点
• 只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或 插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较 有限。
• 本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较 清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力 了.
第一节 酶定向进化的特点
• 适应面广 • 目的性强 • 效果显著
第二节 酶基因随机突变的方法
• 一、易错PCA重组, DNA改组）技术为代表的有 性突变
一、易错PCR技术为代表的无性突变
• 无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶 基因库以便筛选。主要的手段包括易错PCR、盒式诱变、随 机定位诱变等。
部分酶的定向进化与稳定性课件
•部分酶的定向进化与稳定性
•9
三．定向进化的选择策略
关键突变和筛选 突变——采用回交法 筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和
X光片消化分析
•部分酶的定向进化与稳定性
•10
DNA shuffling
•部分酶的定向进化与稳定性
•11
体 外 定 向 进 化
•部分酶的定向进化与稳定性
•12
•部分酶的定向进化与稳定性
•21
Chiral selectivity of lipB68
Model Reaction：Chiral resolution of -phenylethanol
and -phenylpropanol via esterification.
O
O H R
lip a s elip B 6 8
O
O
O H
O O
H N
HCl
N H
O
O OMe
O O
NO
O
HO O HO
O OH
OH
HO O
OAc AcO
AcO
O O
O OAc
OH HO
HO
O O
O OH
OH HO
HO
O H N
NHAc O
•部分酶的定向进化与稳定性
HO N
O OR
•26
Synthesis of ibuprofen glucopyranside derivative
•部分酶的定向进化与稳定性
•30
四．杂合酶
来自不同酶分子中的结构单元或是整个 酶分子进行组合或交换，以产生具有所 需性质的优化酶杂合体。
•部分酶的定向进化与稳定性
酶的定向进化讲义教材
2020/4/15
4.基因家族重排技术
2020/4/15
2020/4/15
2020/4/15
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶Байду номын сангаас子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2020/4/15
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2020/4/15
酶定向进化的基本过
酶基因
随机15
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改变
正常PCR的反应条件的技术 在进行PCR 扩增目的基因时， 使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的 基因发生随机突变。是一种非重组型构建突变的方法。2020/4/15
酶分子的定向进化
2020/4/15
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
2.DNA重组技术(又称有性PCR)
• 是基因在分子水平上进行有性重组 (sexualcombination) 。该方法由stemmer 于1994年引入到蛋白质的定向进化过程中, 并成功地改造了数十种具有工业用途的蛋
4.基因家族重排技术
2020/4/15
2020/4/15
2020/4/15
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶Байду номын сангаас子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
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酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2020/4/15
酶定向进化的基本过
酶基因
随机15
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改变
正常PCR的反应条件的技术 在进行PCR 扩增目的基因时， 使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的 基因发生随机突变。是一种非重组型构建突变的方法。2020/4/15
酶分子的定向进化
2020/4/15
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
2.DNA重组技术(又称有性PCR)
• 是基因在分子水平上进行有性重组 (sexualcombination) 。该方法由stemmer 于1994年引入到蛋白质的定向进化过程中, 并成功地改造了数十种具有工业用途的蛋
酶的定向进化
2019/11/9
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
【正式版】酶的定向进化PPT
因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
DNA改组技术 ➢ 特点：正突变频率高，进化速度快。 ➢ 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组
从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌 素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同 源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高 了540倍。
3、基因家族之间的同源重组 1、易错PCR技术为代表的无性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexual PCR）。 1、易错PCR技术为代表的无性进化
易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
3、基因家族之间的同源重组 反应条件：提高Mg2+浓度；
4.6.3 酶基因的随机突变
1、易错PCR技术为代表的无性进化
定向进化的基无本规性则是“突获取变你所：筛选的向突变单体”一。 酶分便筛选。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。
酶的定向进化
➢ 酶分子的定向进化（directed evolution）：模 拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在 体外得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
平板筛选技术 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
➢ 转化向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
DNA改组技术 ➢ 特点：正突变频率高，进化速度快。 ➢ 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组
从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌 素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同 源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高 了540倍。
3、基因家族之间的同源重组 1、易错PCR技术为代表的无性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexual PCR）。 1、易错PCR技术为代表的无性进化
易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
3、基因家族之间的同源重组 反应条件：提高Mg2+浓度；
4.6.3 酶基因的随机突变
1、易错PCR技术为代表的无性进化
定向进化的基无本规性则是“突获取变你所：筛选的向突变单体”一。 酶分便筛选。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。
酶的定向进化
➢ 酶分子的定向进化（directed evolution）：模 拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在 体外得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
平板筛选技术 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
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• 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 • 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后
者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起 着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用， 整个进化过程完全是在人为控制下进行的
NA改组和外显子改组
DNA改组（DNA shuffling）又称有性
➢定向诱变：
点突变——碱基删除、增补和替换
➢随机诱变：
易错PCR法(Error-prone PCR)——
❖ 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） ❖ 加入dITP来代替被减少的dNTP ❖ 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
➢基因的直接进化（directed evolution)
可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题
基因直接进化的用途
提高酶活性——天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30
倍
改变底物特异性和对映异构体选择性——
酯酶可水解非天然酯类
改善酶的工艺性——冷适应和热适应酶 改变酶的拓扑结构——二体酶变为单体酶 获取许多新的理论知识
酶的合理 设计
体外定向进化的意义
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，
很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
• 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶 的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊 的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组 和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选 择出所需性质的突变酶。
突变方法 易错PCR DNA改组 盒式诱变 易错PCR/DNA改组 盒式诱变 DNA改组 DNA改组 易错PCR/DNA改组 随机/定位诱变 DNA改组
回本章目录
分子进化工程的种类
人工获取新基因的方法
➢常规的基因工程方法
生物功能 蛋白质 基因
➢新基因的理性设计和人工合成
根据已有基因的序列和功能进行设计
PCR(sexual PCR)，原理。 该策略的目的是创造将亲 本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变 异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不 仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的 已优化性质合为一体。
外显子改组（exon shuffling）类似于DNA
改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前 者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内 含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产 生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显 子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而 DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。
高通量的筛选体系
酶的体外定向进化应用实例
酶 枯草杆菌蛋白酶E
β-内酰胺酶 枯草杆菌蛋白酶BPN′
对硝基苯酯酶 胸腺嘧啶核苷激酶
β-半乳糖苷酶 绿色荧光蛋白
核酶 天冬氨酸酶 药物和疫苗
性质 有机相活性/稳定性 总活力/底物专一性
稳定性 底物专一性/有机相活性
底物专一性 底物专一性
荧光 底物专一性 活性与稳定性 活性/专一性/最佳表达
• 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工
程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理 设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和 医药等领域逐渐显示其生命力。
定向进化的原理
• 在待进化酶基因的PCR扩增5’校对功能的性质，配合适当条 件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构 建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的 优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的选择策略
1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选 择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控 制实验条件，限定突变种类， 降低突变率， 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量， 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。
2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质 相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能 产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白 的荧光性质等。
• 分子进化耐热蛋白质特性：
邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变 体8g8的了稳定性提高了17C，但突变的氨基酸数 仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。
基因直接进化的步骤
• 突变
基因突变库的建立
• 筛选
基因突变库的活体或离体筛选
• 基因复制与遗传
建立基因突变库的方法
生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
酶的定向进化
• 酶分子的合理设计(rational design) • 酶分子的定向进化(directed evolution)
基因直接进化的用途
• 提改变酶的特性----多功能或单功能酶 • 高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高
30倍
• 改变底物特异性和对映异构体选择性----酯
酶可水解非天然酯类
• 改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶 • 改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单
体酶变为二体酶
• 获取许多新的理论知识
酶工程酶分子定向进化课件
酶分子定向进化
• 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于
蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略， 是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生 物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵 敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。与传统 的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间 结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地 创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机 突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基 因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择） 技术，获得具有某些预期特征的改构酶。
TLPs 的失活曲线
TLP-ste突变蛋白的三维结构
酶拓扑结构的变化
蛋白质的耐热机制
• 天然耐热蛋白质特性：
减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比； 除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去 支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。
所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不 超过75%。
者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起 着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用， 整个进化过程完全是在人为控制下进行的
NA改组和外显子改组
DNA改组（DNA shuffling）又称有性
➢定向诱变：
点突变——碱基删除、增补和替换
➢随机诱变：
易错PCR法(Error-prone PCR)——
❖ 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） ❖ 加入dITP来代替被减少的dNTP ❖ 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
➢基因的直接进化（directed evolution)
可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题
基因直接进化的用途
提高酶活性——天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30
倍
改变底物特异性和对映异构体选择性——
酯酶可水解非天然酯类
改善酶的工艺性——冷适应和热适应酶 改变酶的拓扑结构——二体酶变为单体酶 获取许多新的理论知识
酶的合理 设计
体外定向进化的意义
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，
很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
• 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶 的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊 的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组 和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选 择出所需性质的突变酶。
突变方法 易错PCR DNA改组 盒式诱变 易错PCR/DNA改组 盒式诱变 DNA改组 DNA改组 易错PCR/DNA改组 随机/定位诱变 DNA改组
回本章目录
分子进化工程的种类
人工获取新基因的方法
➢常规的基因工程方法
生物功能 蛋白质 基因
➢新基因的理性设计和人工合成
根据已有基因的序列和功能进行设计
PCR(sexual PCR)，原理。 该策略的目的是创造将亲 本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变 异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不 仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的 已优化性质合为一体。
外显子改组（exon shuffling）类似于DNA
改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前 者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内 含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产 生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显 子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而 DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。
高通量的筛选体系
酶的体外定向进化应用实例
酶 枯草杆菌蛋白酶E
β-内酰胺酶 枯草杆菌蛋白酶BPN′
对硝基苯酯酶 胸腺嘧啶核苷激酶
β-半乳糖苷酶 绿色荧光蛋白
核酶 天冬氨酸酶 药物和疫苗
性质 有机相活性/稳定性 总活力/底物专一性
稳定性 底物专一性/有机相活性
底物专一性 底物专一性
荧光 底物专一性 活性与稳定性 活性/专一性/最佳表达
• 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工
程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理 设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和 医药等领域逐渐显示其生命力。
定向进化的原理
• 在待进化酶基因的PCR扩增5’校对功能的性质，配合适当条 件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构 建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的 优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的选择策略
1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选 择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控 制实验条件，限定突变种类， 降低突变率， 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量， 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。
2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质 相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能 产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白 的荧光性质等。
• 分子进化耐热蛋白质特性：
邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变 体8g8的了稳定性提高了17C，但突变的氨基酸数 仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。
基因直接进化的步骤
• 突变
基因突变库的建立
• 筛选
基因突变库的活体或离体筛选
• 基因复制与遗传
建立基因突变库的方法
生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
酶的定向进化
• 酶分子的合理设计(rational design) • 酶分子的定向进化(directed evolution)
基因直接进化的用途
• 提改变酶的特性----多功能或单功能酶 • 高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高
30倍
• 改变底物特异性和对映异构体选择性----酯
酶可水解非天然酯类
• 改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶 • 改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单
体酶变为二体酶
• 获取许多新的理论知识
酶工程酶分子定向进化课件
酶分子定向进化
• 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于
蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略， 是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生 物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵 敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。与传统 的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间 结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地 创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机 突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基 因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择） 技术，获得具有某些预期特征的改构酶。
TLPs 的失活曲线
TLP-ste突变蛋白的三维结构
酶拓扑结构的变化
蛋白质的耐热机制
• 天然耐热蛋白质特性：
减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比； 除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去 支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。
所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不 超过75%。