高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留

高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留

摘要:为了建立高效液相色谱-荧光测定畜禽粪污中氧氟沙星､诺氟沙星､环丙沙星､恩诺沙星残留的分析方法,将畜禽粪便样品经乙腈超声提取,再经正己烷液-液萃取,并经氮吹浓缩,乙腈与水混合溶解残渣,过微孔滤膜,采用高效液相色谱-荧光检测,以0.01 mol/L四丁基溴化胺(pH 3.0)/乙腈(94/6,V/V)为流动相,于激发波长280 nm､发射波长480 nm处进行检测｡结果表明,畜禽粪污样品中4种喹诺酮类抗生素的平均回收率为77.8%~98.2%,相对标准偏差为 3.5%~7.2%,检测限为0.005~0.010 μg/kg｡该方法简便､快速,可满足畜禽粪污中4种喹诺酮类兽药残留量的同时检测｡

关键词:畜禽粪污;喹诺酮类抗生素;高效液相色谱法;荧光检测

Determination of Four Kinds of Fluoroquinolones Antibiotics Residues in Livesotck Feces by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection

Abstract:A reversed-phase high performance liquid chromatography method has been developed for the simultaneous determination of four fluoroquinolones antimicrobial residues in livesotck feces. The samples were ultrasonically extracted by acetonitrile, followed by a double liquid-liquid extraction with n-hexane. After the solvent was vaporized by nitrogen stream, four analytes were analysed by high performance liquid chromatography-fluorimetric detection with excitation and emission wavelength of 280 nm and 480 nm, respectively, using 0.01 mol/L tetrabutyl ammonium bromide(pH 3.0)/acetonitrile (94/6,V/V) as the mobile phase. The average recoveries of the four fluoroquinolones in livesotck feces ranged from 77.8% to 98.2%, and relative standard deviation were 3.5%~7.2%. The detective limit for four quinolones were from 0.005 to 0.010 μg/kg. The results indicated that the developed multiresidues method were easy and fast. It has also demonstrated that the method could meet the requirements for simultaneous determination of four kinds of fluoroquinolones antibiotics in livestock feces.

Key words: livestock feces; fluoroquinolones antibiotics; high performance liquid chromatography; fluorescence detect

近年来,随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的发展,抗生素作为饲料添加剂等越来越被广泛地应用于畜禽养殖业中｡兽用药物在保障动物健康､提高畜禽生产力和改善人民生活水平等方面都起着重要的作用,兽用药物的种类及用量与日俱增,尽管抗生素作为兽药和饲料添加剂在畜禽疾病防治和生长促进方面发挥了较大的作用,然而,抗生素通过口服或肌肉注射进入动物体内后,仅少量被内脏器官吸收利用,约30%~90%以原药和代谢产物的形式经动物的粪便和尿液进入生态环境中,给环境土壤､表层水体等生态环境带来不良影响[1]｡目前,畜禽养殖粪便及其施肥土壤中的兽用抗生素污染已经达到较为严重的程度,畜禽粪便中抗生素带来的环境污染问题引起了各方面的关注和重视[2]｡

喹诺酮类药物是最近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素,是继磺胺类药物之后人类在合成抗生素方面最重要的突破,其抗菌作用是磺胺类药物的近千倍｡氟喹诺酮(Fluoroquinolones,FQs)类药物是第三代喹诺酮类药物,广泛地用于畜禽的细菌､霉形体病防治,已投入使用或即将进人兽医领域的药物有10多种,目前国内外已批准用于动物的FQs包括恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)､诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)､环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)､氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)等[3]｡

近年来,氟喹诺酮类抗生素已在水环境､土壤环境和畜禽废物中有不同程度的检出[4-8]｡对水环境､土壤､肉､奶､蛋等中氟喹诺酮类抗生素残留检测技术的研究较多,主要是采用液相色谱-质谱联用方法,但利用高效液相色谱仪分析畜禽粪便中氟喹诺酮类抗生素的报道很少｡为此,本研究建立了高效液相色谱-荧光检测同时测定土壤中4种氟喹诺酮类抗生素的分析方法,旨为畜禽粪便中抗生素兽药残留提供技术支持｡

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪(配荧光检测器),Million-Q超纯水制备系统,超声波清洗器,旋涡混合器,离心机,精密pH计,氮吹仪等｡

4种氟喹诺酮类抗生素标准品:氧氟沙星(OFL)､诺氟沙星(NOR)､环丙沙星(CIP)和恩诺沙星(ENR),纯度>99.0%,Sigma公司｡甲醇和乙腈,色谱纯,Fisher公司;其余试剂均为分析纯;实验用水为超纯水｡

1.2 试验方法

1.2.1 粪尿样品的前处理

1)畜禽粪便:准确称取待测鸡或猪粪便10.00 g,置于50 mL离心管中,加20 mL 乙腈和2 g无水硫酸钠浸泡提取,在漩涡混匀器上以2 500 r/min混匀1 min,45 ℃超声25 min,4 000 r/min离心10 min,将上清液转入浓缩瓶中,再重复提取两次,合并上清液,样品上层清液用40 mL正己烷萃取两次,氮气吹至近干,用2 mL乙腈饱和的正己烷溶解残余物,转入10 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,弃去正己烷层,下层清液用尼龙微孔滤膜过滤,供高效液相色谱仪测定｡

2)畜禽尿液及养殖废水:取畜禽尿液及养殖废水30 mL,4 000 r/min离心10 min,将上层清液用40 mL正己烷萃取两次,氮气吹至近干,用2 mL乙腈饱和的正己烷溶解残余物,转入10 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,弃去正己烷层,下层清液用尼龙微孔滤膜过滤,供高效液相色谱仪测定｡

1.2.2 色谱条件Waters色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);激发波长为280 nm,发