检测两种蛋白质之间相互作用
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
检测蛋白互作的方法
检测蛋白互作的方法有多种，其中包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀、GST-pull down实验等。
这些方法都可以用来研究蛋白之间的相互作用，并有助于进一步了解蛋白质的功能和机制。
1. 酵母双杂交技术：这是一种在酵母细胞中检测蛋白互作的方法，主要通过将两个蛋白的基因分别与报告基因的转录激活域融合，在两个蛋白相互作用时，报告基因就会被激活，从而得到蛋白互作的结果。
2. 免疫共沉淀：这是一种通过抗体和抗原之间的专一性作用来研究蛋白互作的方法。
将其中一个蛋白进行免疫沉淀后，与其互作的蛋白也会被沉淀下来，然后通过Western blot等技术检测到被沉淀的蛋白，从而确定两者之间的相互作用。
3. GST-pull down实验：这是一种体外检测蛋白互作的方法，通过将目标蛋白与谷胱甘肽亲和树脂结合，再与待检测的蛋白混合，如果两者之间有相互作用，目标蛋白就会与待检测蛋白结合并被吸附在树脂上，最后通过Western blot等技术检测到结合的蛋白，从而证明两者之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较1。
生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法。
改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。
缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。
另外灵敏度不如亲与色谱高、●Far－Ｗeｓtern又叫做亲与印记、将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用,最后显影。
缺点就是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术(Ｓｕｒfａce plaｓｍon ｒeｓonａｎce)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面、当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升,从而导致共振角度得改变。
而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。
该技术不需要标记物与染料,安全灵敏快速,还可定量分析。
缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。
ﻫ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成。
分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。
缺点:自身有转录功能得蛋白会造成假阳性、融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。
不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。
ﻫ５. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(〈100埃)时,它们之间可发生能量转移得现象、荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。
它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
检测蛋白质相互作用的方法
检测蛋白质相互作用的方法蛋白质相互作用对于理解细胞内的生物过程以及研究疾病机制具有重要意义。
随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，越来越多的蛋白质相互作用被鉴定出来，为进一步研究提供了基础。
本文将介绍几种常用的蛋白质相互作用检测方法，包括传统的生化方法以及近年来发展的高通量技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）：免疫沉淀是一种常用的生化方法，用于检测蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
该方法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，将其与结合蛋白质一起从混合溶液中沉淀下来。
通过检测共沉淀的蛋白质可以确定其相互作用伙伴。
这种方法可以应用于细胞培养液、组织样品以及原核和真核生物体内。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）：酵母双杂交是一种用于检测蛋白质与其他蛋白质的直接相互作用的方法。
该方法利用酵母细胞内的转录激活子和靶蛋白质的交互作用来驱动报告基因的表达。
通过将靶蛋白质与转录激活子的两个域分别与两个不同的蛋白质结合区域相连，可以检测他们之间的相互作用。
该方法可用于鉴定蛋白质复合物的成员以及研究蛋白质与DNA、RNA、药物等的相互作用。
3. 蛋白质微阵列（Protein Microarray）：蛋白质微阵列是一种高通量技术，用于同时检测大量蛋白质的相互作用。
该方法将数千种蛋白质固定在玻璃片或芯片上，并与待测蛋白质进行相互作用。
通过检测待测蛋白质与已知蛋白质之间的相互作用，可以快速鉴定蛋白质复合物的成员，以及确定蛋白质的结合亲和力和特异性。
4. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：质谱法是一种基于蛋白质质量-电荷比的测量，用于鉴定蛋白质相互作用。
质谱法可分为两种类型：基于质量鉴定的质谱法（如蛋白质酶切质谱法）和基于质量比的质谱法（如蛋白质亲和质谱法）。
利用质谱法，可以鉴定蛋白质复合物的成员，并获得有关相互作用和结合位点的信息。
质谱法在高通量筛选和蛋白质组学研究中被广泛应用。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
蛋白质相互作用研究方法
蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间的相互作用和相互调节。
研究蛋白质相互作用的方法有很多种，下面将介绍其中一些常用的方法。
1. 酵母双杂交检测（Y2H）：该方法是通过基因转录和细胞生理过程来检测蛋白质相互作用。
该方法的基本原理是将感兴趣的两个蛋白质分别连接到酵母细胞中的转录因子的DNA结合结构域和激活结构域，当这两个蛋白质发生相互作用时，转录因子被激活，从而触发报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平来确定蛋白质之间的相互作用程度。
2. 免疫共沉淀：该方法是利用两个蛋白质之间的特异性相互作用来检测和分离它们。
首先，在一个蛋白质中引入一个标签，比如His标签。
然后，将该蛋白质在体外与另外一个感兴趣的蛋白质一起孵育，使它们发生相互作用。
最后，利用特定的抗体识别标签，并用亲和树脂或磁珠来沉淀包含这些标签的复合物。
通过酶解、电泳等方法对复合物进行分析，可以确定两个蛋白质之间的相互作用。
3. 光学方法：如可以利用荧光共振能量转移（FRET）技术来研究蛋白质相互作用。
该技术基于两个发射荧光染料的距离变化会改变吸光度的原理，当两个蛋白质相互作用时，可以通过激发一个染料并检测另一个染料发射的荧光信号来确定它们之间的相互作用程度。
4. 质谱法：质谱法是一种广泛应用的蛋白质相互作用研究方法。
其中，串联质谱法（MS/MS）可以用来鉴定蛋白质复合物中的组分。
根据质谱分析的结果，可以确定两个蛋白质之间的相互作用和结合部位等信息。
此外，还有其他一些方法如共结晶、核磁共振、冷冻电镜等，可以对蛋白质相互作用进行研究。
这些方法的选择取决于研究者所关注的蛋白质特性、相互作用类型以及研究目的等因素。
需要注意的是，以上方法在研究蛋白质相互作用时有其局限性。
比如，一些方法需要在体外进行，无法反映细胞内环境；一些方法可能对于某些蛋白质的研究不适用；一些方法可能存在假阳性和假阴性等问题。
因此，在选择研究方法时，需要综合考虑各种因素，并采取多重方法相互印证，以获得准确可靠的结果。
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
有多种方法可以检验蛋白质与蛋白质相互作用：
1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）：通过抗体选择性地沉淀出蛋白质复合物，并利用Western blot等技术检测相互作用蛋白质的存在。
2. 蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography）：将一个蛋白质固定于树脂上，然后通过蛋白质与其交互作用的其他蛋白质在层析柱中保留，并通过洗脱和分析来确认相互作用。
3. 光敏交联（photocrosslinking）：通过使用光敏交联剂，使两个相互作用的蛋白质发生共价化学反应，并通过分子量分析等技术来确定相互作用。
4. 双杂交实验（yeast two-hybrid assay）：利用酵母中的转录激活子结构域和DNA结合结构域的解偶联来检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5. 表面等离子共振（surface plasmon resonance）：利用传感器芯片上吸附的一个蛋白质通过流动相与另一个相互作用蛋白质进行实时监测，并测定其结合亲和力和动力学参数。
这些方法都能有效地检验蛋白质与蛋白质相互作用，具体选择哪一种方法还需根据实验目的和条件来决定。
蛋白质与蛋白质相互作用的检测方法
蛋白质与蛋白质相互作用的检测方法蛋白质与蛋白质相互作用是调节细胞内外的生命过程不可缺少的过程。
因此，有效地检测和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用具有重要意义。
目前，有许多方法可以检测蛋白质与蛋白质相互作用，例如传统的生化实验、蛋白质结晶、核磁共振等。
本文将对常见的检测蛋白质与蛋白质相互作用的方法做一详细介绍。
1. 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术SPR技术利用将某一配体固定在芯片上的方法，监测样品中的交互分子（配体和配体的模拟物质）与溶液中生物大分子之间的交互作用，这种方法可以被用于定量分析蛋白质与蛋白质的结合能力和动力学参数。
SPR的原理基于光的表面等离子共振现象，其基本的原理是，当一束光源通过激发表面电离振荡时，会在金属表面的一侧形成一层薄的电荷区，这形成的电场会部分穿透到溶液中的试样中，因为试样中的高分子与金属表面的电场存在交互作用，而改变金属表面的局部折射率，阻尼了电场振荡，则会影响反射和折射的光子。
利用这些影响，可以通过反射光强的检测来监测其与蛋白质之间的交互作用。
2. RNA交互固定蛋白质标记（RNA Interactome Capture）技术RNA Interactome Capture技术是一种基于RNA分子特异性的分子识别技术，可以用来分离和鉴定与RNA相互作用的蛋白质。
其原理是利用生物素标记的RNA分子固定蛋白，这可以通过RNA蛋白质相互作用来捕获蛋白质，并将其分离并鉴定。
3. 凝胶滤渗法（Gel filtration Chromatography，GFC）Gel filtration Chromatography是一种分子分离技术，主要通过分离样品中的差异和纯化样品，可以分离出大小、形状等因素不同的蛋白质以及富含特定簇周期的化合物。
该技术主要应用于蛋白质纯化和筛选，其原理是基于纯化的蛋白质与使用的凝胶柱基质之间的分子大小识别。
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术主要包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、荧光能量转移技术、噬菌体展示技术等。
这些技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，从而深入了解生命活动的机制。
1.酵母双杂交技术：这是一种有效的筛选蛋白质相互作用的方法，尤其适用
于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
通过将目标蛋白与报告基因连接，在酵母细胞中检测报告基因的表达，可以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
2.免疫共沉淀技术：利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标蛋白与其他
相关蛋白一起沉淀下来，然后通过Western blot等技术对沉淀的蛋白质进行分析。
通过这种方法可以检测到目标蛋白与其他蛋白质的直接相互作用或者间接相互作用。
3.荧光能量转移技术：一种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法。
该技术
利用荧光物质标记目标蛋白，通过检测荧光物质之间的能量转移，来间接检测蛋白质之间的相互作用。
4.噬菌体展示技术：将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因的技术，使外源基
因编码的蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合，并在噬菌体表面展示出来。
通过该技术可以筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质，并对相互作用进行定量分析。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。
蛋白质之间的相互作用
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异
性结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
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蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较蛋白质相互作用是生物学研究中的重要课题，对于理解细胞生物过程以及疾病的发病机制具有重要意义。
目前已经开发出多种实验方法用于检测蛋白质相互作用，其中最常用的方法包括：免疫共沉淀、双杂交、表面等离子共振、斑点免疫印迹、荧光共振能量转移（FRET）和生物传感等。
下面将对这些方法进行比较。
免疫共沉淀是一种利用抗体特异性识别蛋白质相互作用的方法。
通过特异性抗体与检测蛋白质结合，将目标蛋白质及其相互作用的蛋白质一起通过沉淀进行分离和检测。
这种方法常用于检测蛋白质复合物，缺点是需要高质量的抗体，抗体的选择和结合效率对结果的可靠性有较大的影响。
双杂交是一种检测蛋白质相互作用的基因工程方法。
该方法利用两个蛋白质的相互作用引起的转录活性调控来筛选蛋白质相互作用。
该方法的优点在于操作简单，筛选速度较快，但是可能存在假阳性结果以及对蛋白质的折叠状态和后转录修改对结果的影响。
表面等离子共振是一种通过测量光敏感表面上的变化来检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过共振的光波与蛋白质结合引起的表面层折射率变化来测量蛋白质的结合动力学参数。
该方法的优点在于实时、直接、无标记以及高灵敏度。
斑点免疫印迹是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过将蛋白质分离电泳然后向膜转移，并使用特异性抗体来探测蛋白质的相互作用。
该方法的优点包括操作简单，对蛋白质的结构没有要求，但是这种方法不能提供定量信息。
荧光共振能量转移（FRET）是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过基于荧光分子之间的非辐射能量转移来测量蛋白质的相互作用。
该方法对于分子间距离和颗粒之间的角度较敏感。
FRET要求有适当的选择标记的蛋白质，并能够量化蛋白质的相互作用。
生物传感是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过表面增强拉曼散射（SERS）或增强荧光技术来获得蛋白质的信号。
该方法对于小样本和灵敏度要求较高的蛋白质相互作用研究具有优势，但需要专门的实验条件和设备。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用蛋白质之间的相互作用对于维持生物体的正常功能至关重要。
了解和研究蛋白质之间的相互作用有助于揭示生物过程、疾病的发生机制，并为治疗和药物开发提供指导。
在本文中，我们将讨论目前常用的蛋白质相互作用检测方法，并介绍一些重要的应用实例。
目前常用的蛋白质相互作用检测方法包括生化技术、免疫学技术、生物物理学技术等。
其中，生化技术主要包括亲和层析法、酵母双杂交法、共沉淀法等。
亲和层析法是一种基于结合亲和剂和标靶蛋白质之间氢键、离子键或疏水键等非共价作用力的检测方法。
该方法常用于寻找特定蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
酵母双杂交法则是通过将酵母细胞中的两个互补蛋白质结合并激活报告基因来检测蛋白质之间的相互作用。
共沉淀法则是利用抗体或亲和剂将特定蛋白质与其他蛋白质结合后，通过共沉淀的方式来检测相互作用。
免疫学技术主要包括免疫沉淀法、免疫共沉淀法和免疫荧光法等。
免疫沉淀法和免疫共沉淀法是基于抗体与蛋白质之间的特异性结合来检测相互作用。
通过抗体对特定蛋白质进行沉淀或共沉淀，从而寻找与其相互作用的蛋白质。
免疫荧光法则是通过标记特定抗体或蛋白质，利用荧光探针检测该蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用。
生物物理学技术则是基于蛋白质的物理特性来检测相互作用，包括核磁共振、表面等离子体共振、荧光共振能量转移等。
核磁共振是一种基于核磁共振现象来研究蛋白质分子结构和动力学的方法。
表面等离子体共振则是通过检测蛋白质与表面等离子体之间的相互作用来定量测定相互作用强度和亲和力。
荧光共振能量转移则是一种利用荧光能量的非辐射转移来研究蛋白质相互作用的方法。
该技术通常通过荧光标记过程中的能量转移来检测蛋白质之间的互作。
通过以上的方法，研究者们可以检测蛋白质之间的相互作用，并进一步研究这些相互作用在生物体中的功能和机制。
下面我们将介绍一些重要的蛋白质相互作用的应用实例。
1.药物发现：许多药物的作用机制是通过干扰特定蛋白质之间的相互作用来发挥的。
蛋白互作实验方法
蛋白互作实验方法蛋白互作是指蛋白质之间通过物理或化学相互作用形成复合物的过程。
了解蛋白互作的机制对于揭示细胞内不同蛋白之间的功能关系和信号传递网络具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白互作实验方法。
1. 免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）免疫共沉淀法是一种常用的检测蛋白互作的方法。
其基本步骤为首先选择目标蛋白A，通过特异性抗体结合于固相支持上（如Protein A/G琼脂糖），形成免疫寡聚体；然后用该寡聚体与细胞提取物混合，使抗体与目标蛋白A结合；接下来通过离心将复合物沉淀下来，洗脱杂质，最后将沉淀复合物进行热解、电泳分离和Western blot进行检测。
如结果显示目标蛋白B出现在沉淀物中，则可以判定蛋白A与蛋白B存在互作关系。
2. 酵母双杂交实验（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交实验是一种常用的高通量筛选蛋白互作的方法。
其基本原理是将目标蛋白A与一个转录因子的DNA结合域（DBD）融合，形成A-DNA融合蛋白；同时将潜在互作蛋白B与一个激活因子的激活域（AD）融合，形成B-AD融合蛋白。
当A-DNA与B-AD融合蛋白发生互作后，激活域和DNA结合域相互接触，促使报告基因的表达，从而在选择培养基上形成特定的生长。
通过这种方式，可以大规模筛选蛋白互作。
3. 荧光共定位实验荧光共定位实验是一种直观、快速的检测蛋白互作的方法。
通过融合兴趣蛋白A 与绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（mCherry）等荧光标记蛋白，将其表达于细胞中。
如果蛋白A与蛋白B发生互作，并且它们定位于细胞的相同或相邻位置，那么在显微镜下观察到的荧光信号将重叠出现。
通过这种方法，可以直观地观察蛋白互作的情况。
4. 基于亲和柱的互作分析基于亲和柱的互作分析是一种高效的检测蛋白互作的方法。
亲和柱是一种包含特定亲和配体（如金属离子、抗原-抗体、蛋白A/G等）的柱状介质。
首先将一个潜在的互作蛋白A融合到亲和配体上，使其固定在亲和柱上；然后将细胞提取物加载到亲和柱上，使蛋白A能与目标蛋白B结合；接下来通过洗脱步骤将非特异性结合的蛋白去除，最后用适当的方法检测目标蛋白B的存在。
蛋白互作的检测方法
蛋白互作的检测方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白互作是指两个或多个蛋白质相互作用形成复合物的过程。
在细胞内，蛋白质互作是非常常见的，因为蛋白质之间的相互作用对于细胞功能的调控至关重要。
研究蛋白质之间的互作关系对于理解细胞功能和疾病的发病机制具有重要意义。
为了检测和研究蛋白质的互作关系，科学家们发展了多种方法和技术。
一、酵母双杂交酵母双杂交是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用关系。
该方法利用酵母菌中的转录因子进行蛋白质互作的筛选。
通过将感兴趣的蛋白质与一个已知的转录因子的DNA结合域结合，构建一个"鱼钩"。
然后，将这个"鱼钩"与一个另一个已知的转录因子的激活域结合，构建一个"鱼饵"。
将这两个构建好的蛋白质构建载入酵母细胞中，观察是否有染色反应，从而判断两蛋白质之间是否相互作用。
二、共沉淀法共沉淀法是另一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用关系。
该方法利用蛋白质之间的物理相互作用在溶液中形成复合物，通过添加沉淀剂将复合物沉淀下来，最后通过蛋白质生化分析技术检测复合物的成分。
这种方法可以用于检测蛋白质之间的直接相互作用或间接相互作用。
三、共定位法共定位法是用来检测蛋白质之间的相互作用关系的一种方法。
该方法通过检测蛋白质在细胞中的亚细胞定位来判断蛋白质之间是否有相互作用。
如果两个蛋白质在细胞内定位在同一位置，则可以判断它们之间可能存在相互作用关系。
这种方法可以通过共荧光定位或共标记等技术来实现。
四、蛋白质片段互作检测法要想检测蛋白质之间的互作关系，需要综合运用多种方法和技术。
不同的方法有不同的优缺点，可以根据具体研究目的来选择合适的方法。
通过研究蛋白质之间的互作关系，可以更深入地理解细胞功能和疾病发病机制，为进一步研究和治疗疾病提供重要依据。
【这里是否可以添加一些具体的案例以及最新研究进展，来使文章更加生动和有说服力】。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用① FRET技术（in vivo）FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
② 酵母双、三杂交技术（in vivo）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
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检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较1、生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。
缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。
另外灵敏度不如亲与色谱高。
●Fａr—Ｗestｅrｎ又叫做亲与印记。
将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点就是转膜前需要将蛋白复性。
2ﻫ、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。
而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。
该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。
缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。
３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。
不利于核外蛋白研究,会导致假隐性.5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。
它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。
缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。
另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。
ﻫ此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。
1，酵母双杂交 1-5酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子GAL4 得调控表达。
一旦 GAL４蛋白结合到HＩS3 与ｌ a c Z 调控序列相应得位点,则启动报告基ﻫ因得表达.通过检测报告基因得表达判断阳性或阴性。
实际应用中,把 GAL4 基因分成两个部分: ＤＮA 结合区( gal4 DNA ｂindiｎg domａｉn, GBD)与激活区(gal４ａctivａtiｎｇｄomａin， GAＤ）。
分别把 GBD 与GAＤ构建到两个不同得载体上,并能表达相应得两个融合蛋白( GBD－Ｘ与ﻫGＡD—Y)。
然后把 GＢD-X 与 GＡD—Y 两种载体共转染到带有报告基因得酵母细胞中。
当GBD —Ｘ融合蛋白中 X 蛋白与ＧＡD-Ｙ融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时(或结合在一起时）,就使得原本分开得 GＢD 与ＧＡD 蛋白靠近并具有完整得ＧAL4 蛋白得功能，从而能够激活报告基因得ﻫ表达。
（ 1）筛选相互作用得蛋白ﻫ酵母双杂交技术能用于对cDNＡ文库得筛选.把您要研究得蛋白亚克隆到GBD 载体上，ﻫ作为“诱饵”蛋白。
把文库蛋白基因亚克隆到 GAD 载体上。
然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用得蛋白．也许您能够筛选到多株阳性克隆。
虽然酵母双杂交技术具有广泛得应用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有一定得局限性。
酵母双杂交技术最大得弱点就就是假阳性出现率。
所以筛选到得阳性克隆需要进一步得鉴定与功能数据支持。
ﻫ（２) 确定参与结合作用得结构域或mｏtifﻫ当您确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。
您可以先把一个蛋白进行随机缺失,制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力得大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用得氨基酸序列(称为结构域或ｍotiｆ)。
如果一个蛋白分子中具有已知得结构域或mｏtif,也一样进行缺失，瞧就是否这些已知得结构域或mｏｔif 参与结合调节作用。
有得情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质得磷酸化状态有关．这时就需要对可能得磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点就是否参与调节蛋白质得结合作用。
ﻫ2, GST沉淀实验（GST—puｌｌ dｏwn实验)（细胞外蛋白质相互作用) 5-11ﻫ上面提到,用酵母双杂交方法筛选到得蛋白需要作进一步得鉴定。
鉴定方法之一就就是ＧST沉淀实验。
GST 沉淀实验主要就是用来证明蛋白质胞外得相互作用。
蛋白质在胞外得相互作用排除了酵母细胞内复杂体系得干扰,,比较直接地检验蛋白质分子之间存在得物理得相互作用。
同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用得蛋白分子中就是否有参与调节作用得结构域或 moｔif。
ＧＳT 沉淀实验原理就就是, 把您要研究得蛋白基因亚克隆到带有ＧST(谷胱甘肽转移酶）基因得原核表达载体中，并在细菌中表达 GSＴ融合蛋白（ GST—X）。
把GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物得Ｓｅｐhａrose be ａds 上,然后把另一种蛋（ Y）白加入其中。
由于蛋白质之间得结合作用,形成了这样得复合物: ＧST—X-—-—Y。
这一复合物与固体支持物（ Sｅｐｈaｒose beａds)又结合在一起,可以被沉淀下来。
此法又有在不同情况下得具体应用，以下一一作介绍。
ﻫ(１）ＧST 融合蛋白与重组蛋白得相互作用ﻫGＳT 融合蛋白就是在原核表达得,所以没有经过过多得象真核细胞内具有得蛋白修饰作用。
所以另一种用来检验相互作用得蛋白也可以用原核表达出来,也就就是所谓得重组蛋白。
当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白得抗体作 Westｅrn bloｔｔing 检测。
ﻫ（2) GST 融合蛋白与体外 TＮＴ系统合成得多肽或蛋白得相互作用ﻫ用来检验与GST融合蛋白相互作用得蛋白或多肽也可以用ＴＮT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成得蛋白或多肽Ｎ端或Ｃ端加上便于检测得标签。
GＳT融合蛋白沉淀下来得蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽得抗体或标签抗体进行Ｗesｔern ｂlotting检测．如果蛋白之间结合力非常弱,用W ｅsterｎ blottiｎg检测方法难以检测到, 您可以在ＴNT体外合成时给蛋白进行同位素( S32)标记。
这样沉淀下来得蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高。
（3）ＧST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质得相互作用ﻫＧST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用得内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋9２白含量低或结合力弱，可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成得所有蛋白都标记上放射性同位素（ S32),然后提取细胞总蛋白与GSＴ融合蛋白温育。
ＧＳT融合蛋白沉淀下得带有放射性标记得蛋白跑电泳,进行放射自显影。
ﻫ(4）ＧＳＴ融合蛋白与细胞内瞬时表达得蛋白质得相互作用ﻫ当内源性蛋白质含量低，并且有可能影响蛋白质得相互作用,也可以把该蛋白得基因转染到靶细胞内进行过表达，然后检验蛋白质相互作用。
（５） GSＴ融合蛋白与待测蛋白得相互作用有可能与待测蛋白得磷酸化状态有关在进行ＧＳT 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂得情况，具体情况具体分析,分别对待。
比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。
或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用，或者磷酸化得蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。
如果您确实在您得实验中发现了其中一种情况,这将就是一个非常有意义得结果。
ﻫ３,免疫共沉淀(co-immunoprｅｃｉpitatioｎ)(细胞内蛋白质相互作用 ) 9-16免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内就是否有相互作用。
一般来说，两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白得复合物，这样就可以先用一种蛋白得抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白得抗体进行Wｅsｔeｒn blotting 检测,瞧两种蛋白之间就是否确实形成免疫复合物,并能与ｐｒｏteｉn A/G aｇａｒose 一起沉淀下来．免疫共沉淀原理简单，但技术极为复杂。
因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多。
如果两种蛋白之间可以发生相互作用，并不就是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起(足以满足细胞功能需要).在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成得复合物得稳定性使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内得结合力确实非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功。
如果知道发生相互作用得两个蛋白都就是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白，再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景得干扰.关于两种蛋白质之间胞内得相互作用，有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。
( 1) 细胞内过表达蛋白得免疫共沉淀证明蛋白质胞内相互作用时，可以选择一个高效瞬时过表达系统(至于这一系统就是否有内源性靶蛋白无关紧要)。
一般采取CO Ｓ细胞作为真核表达株。
把两种蛋白基因共转染到 CＯＳ细胞内进行表达。
由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用得复合物得量也相应增多.如果您手头没有这两种蛋白得抗体,可以把这两种蛋白得一端分别加上标签以融合蛋白形式表达，然后用商业化得抗标签抗体进行免疫共沉淀与 Wesｔerｎｂlottiｎg 检测.ﻫ( 2) 细胞内源性蛋白得免疫共沉淀ﻫ把两种蛋白共转染到COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但就是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实得蛋白质相互作用。
要想克服这一弱点,可以做内源性得免疫共沉淀实验。
这一技术要求极高，难度极大,但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低，结合在一起形成复合物得量更低,难以检测。
首先要证明所选择得细胞9３系就是否具有这两种内源性得蛋白。
另外,用于免疫沉淀与Ｗｅsｔｅrn bｌoｔｔｉng检测得体要好。
细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温与，以保持蛋白复合物得天然结构。
（3) 组织内蛋白得免疫共沉淀ﻫ在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。
取动物组织(脑、肝、脾等）,切碎，匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验．这一结果代表活体中蛋白质相互作用。