《分子生物学检验技术》实验指导
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
《分子生物学检验技术》课程教学大纲
《分子生物学检验技术》课程教学大纲课程编号：课程名称：分子生物学检验技术英文名称：analysis technique of molecular biology课程类型：专业课必修考查总学时：36学分：2.0 理论课学时：30 实验课学时：6适用对象：医学检验专业本科学生一、课程性质与地位分子生物学是医学领域发展最快的学科之一，日新月异的技术使它逐渐成为医学发展的重要支柱。
随着本世纪初人类基因组计划的完成，医学发展进入了一个全新的时代。
疾病基因的不断发现和克隆，使人们对疾病的认识也不断深入，而这些重大的医学进步离不开技术上的更新和发展，生物芯片技术、基因测序技术、毛细管电泳技术等，每一次技术的进步都为分子生物学的发展提供了有力的保障。
分子生物学技术是一门重要的基础和应用课程，教学方式目前主要以理论课程为主，分基础理论和基础技术两个部分，重点讲述分子生物学检验技术的基础理论和基础知识，并引入近年发展的新理论、新技术，使学生了解和学习最新进展和相关内容。
同时分子生物学技术最主要的作用是作为研究医学的一种媒介和工具，具有很强的实践性，其基本知识和理论来源于科学实验，因此现针对本科学生开展了分子生物学实验课程，实验教学是强化理论课的重要方式，是培养医学生实验科学概念和实验技能的重要途径，通过综合性的实验可以强化学生对理论的深入理解和实际运用，可以更全面直观的分析理论知识。
更重要的是，实验教学是培养学生综合分析和解决问题的能力以及科学创新能力的重要方式。
二、教学环节及教学方法和手段本课程是在学生系统学习了前期课程的基础上由检验教研室负责开设的，与本课程相关的基础课程有生物化学和生化技术等。
本课程分为理论课程和实验课程两部分。
理论课主要包括基础理论和基本技术，基础理论主要讲授基因和基因组、原核生物和真核生物基因组、人类基因组计划、蛋白质组学、肿瘤分子生物学等；基本技术包括了核酸提取、DNA重组技术、核酸分子杂交、聚合酶链反应、DNA芯片等。
分子生物学实验
分子生物学实验在分子生物学领域，实验是非常重要的手段，可以帮助科学家们深入研究细胞和遗传信息的奥秘。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常见技术，为读者提供一个全面的了解。
实验准备在进行任何分子生物学实验之前，实验室必须准备好所有必需的试剂和器材。
这些试剂包括DNA酶、引物、缓冲液等，而器材则包括PCR仪、电泳仪、热循环仪等。
此外，实验室还需要保持清洁、有序，以确保实验结果的准确性和可重复性。
核酸提取在进行分子生物学实验时，研究人员通常需要提取目标细胞或组织中的核酸，如DNA和RNA。
这个步骤非常关键，因为核酸是遗传信息的载体，对后续实验至关重要。
PCR扩增PCR（聚合酶链反应）是一种常用的技术，可以在体外复制DNA片段。
通过PCR扩增，科学家们可以快速获得大量特定DNA序列，为后续实验提供充足的材料。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术。
通过在凝胶电泳仪中施加电场，可以使DNA片段根据大小在凝胶中移动，从而实现分离和检测。
蛋白表达和纯化在分子生物学研究中，研究人员经常需要表达和纯化特定蛋白。
通过基因工程技术，科学家们可以将目标基因插入表达载体中，在宿主细胞中大量表达目标蛋白，并通过纯化步骤获得纯净的蛋白样品。
分子克隆分子克隆是将某一DNA片段插入到另一DNA分子中的过程，常用于构建重组DNA、重组蛋白等。
通过分子克隆技术，科学家们可以研究和改变生物体内的基因组成。
实验结果分析一旦实验完成，科学家们需要对实验结果进行分析和解读。
这通常涉及到数据处理、图表绘制、统计学分析等工作，以确保实验结论的准确性和可靠性。
结论与展望分子生物学实验在揭示生命的奥秘和解决重大疾病方面起着至关重要的作用。
随着技术的不断发展和创新，我们相信分子生物学实验将在未来展现出更广阔的发展前景，为人类健康和生活质量带来更多的希望。
希望本文能够帮助读者更好地了解分子生物学实验的基本原理和方法，激发更多人对分子生物学这一神奇领域的兴趣和热爱。
分子生物学实验指导（精）
分⼦⽣物学实验指导（精）分⼦⽣物学实验指导⽣物技术教学室编宁夏⼤学⽣命科学学院2008年8⽉实验⼀分⼦⽣物学实验技术多媒体演⽰[⽬的要求]通过多媒体试验录像进⼀步掌握分⼦⽣物学基本操作技术。
[教学⽅式]多媒体光盘演⽰。
[实验内容]基本的分⼦⽣物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验⼆琼脂糖凝胶电泳检测DNA[⽬的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA⽚段的常⽤⽅法。
DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA分⼦在⾼于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸⾻架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA⼏乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极⽅向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp⾄50 kb的DNA⽚段。
在琼脂糖溶液中加⼊低浓度的溴化⼄锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分⼦⼤⼩在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数⽬的常⽤对数值成反⽐，分⼦越⼤迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度⼀个特定⼤⼩的线形DNA分⼦,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA⽚段迁移速率与所加电压成正⽐。
但是随着电场强度的增加，不同分⼦量DNA⽚段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩⼩。
要使⼤于2kb的DNA⽚段的分辨率达到最⼤，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳⾏为受电泳时的温度影响不明显，不同⼤⼩的DNA⽚段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发⽣明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
《分子生物学检验技术》课程实验教学大纲
《分子生物学检验技术》课程实验教学大纲一、课程编号：17050021课程名称：分子生物学检验技术适用专业：医学检验技术课程类别：专业必修课开课学期：第五学期实验学时： 32 学时学分：4.5学分二、开课实验室：预防医学与医学检验实验中心三、实验教材及参考书教材：《分子诊断学实验指导》，中国医药科技出版社，2015.7参考书：[1] 钱士匀主编.《分子诊断学实验指导》，人民卫生出版社，2012[2] 尹一兵主编.《分子诊断学》，高等教育出版社，2006四、实验教学目的和要求1、重视实验教学环节，选择有代表性的教学内容，加深学生的感性认识，初步培养学生的应用分子生物学检验技术理论指导实践的意识和基本操作能力。
2、通过课堂讲授、实验操作和医院见习，培养学生观察记录实验结果的能力，对实验结果进行科学分析与推理，得出科学的试验结论的能力，使学生具有初步分子生物学检验的综合分析问题和动手解决问题的能力，培养学生严谨的科学态度和创新意识。
五、考核形式要求实验成绩分三部分：（1）实验平时成绩：包括出勤情况及实验报告成绩，按百分制打分，学习结束时汇总平时成绩，占实验总成绩的40％。
（2）实验操作评价成绩，根据每次实验的学习态度和实验操作情况进行综合评价，占实验总成绩的30％。
（3）实验考试成绩：结束时进行笔试，占30%。
六、实验项目及要求七、基本设备与器材配置八、参与本大纲编写人员编写人：袁才佳蒋显勇李木兰实验室主任：何军山《分子生物学检验技术》课程实验考核大纲课程编号：17050021适用专业：医学检验技术课程类别：专业必修课学时学分：32学时 4.5学分一、考核要求1、掌握实验操作原理和注意事项；2、掌握实践操作各项技能，各项技能均能熟练操作。
二、考核评分办法实验成绩分三部分：（1）实验平时成绩：包括出勤情况及实验报告成绩，按百分制打分，学习结束时汇总平时成绩，占实验总成绩的40％。
（2）实验操作评价成绩，根据每次实验的学习态度和实验操作情况进行综合评价，占实验总成绩的30％。
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导简介
本教案旨在帮助高中生掌握分子生物学的基础知识和实验实践指导，深入理解细胞结构、DNA复制和转录、蛋白质合成等关键概念，并能运用所学知识进行实际的实验操作。
第一章：细胞结构与功能
1.细胞的基本组成
2.细胞膜和细胞壁
3.内质网和高尔基体
4.线粒体和叶绿体
5.溶酶体和核小体
第二章：DNA复制与转录
1.DNA的结构与功能
2.DNA复制的原理与过程
3.DNA修复机制
4.RNA的结构与功能
5.转录的过程和调控机制
第三章：蛋白质合成与调控
1.RNA翻译的基本原理与步骤
2.编码RNA和非编码RNA的作用差异
3.翻译后修饰过程及其功能
4.蛋白质合成调控的机制
实验实践指导：
实验一：观察细胞结构
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验二：观察DNA复制过程
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验三：转录和翻译实验操作指导
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.转录实验步骤及结果分析
4.翻译实验步骤及结果分析
总结与思考题：
1.对以上所学知识进行总结归纳，并了解分子生物学在生物科学研究中的意
义。
2.思考如何将所学应用于解决现实问题或开展新的科学研究。
以上是关于高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导的简要概述，包括基础知识内容和相关实验操作指导。
通过本教案，希望能够帮助高中生全面掌握和运用分子生物学方面的知识，培养科学思维和实践能力。
医学检验专业分子生物学检验技术实验教学实践与体会
检验的最新 方 法 ， 已广 泛 应 用 于 检 验学 科 的各 领域 之 中； 如 Ｐ Ｒ技术广泛用于病 原微 生物感 染 的检测和某 些遗传 性疾病 Ｃ 的诊断 。开设《 子生 物学 检验技术 》 分 课程对 检验 医学 专业学 生实验技能有促进作用 ‘ ， ３ 因此与时俱进 地在检验 医种类 繁多 ， 展迅 速 ， 于 医学本 科生 阶 发 对 段来说不可能全 部实 际操作 ， 事实 上也 没有 必要 ， 关键 是要找 到一种有效 的教 学方法 。对 于 医学检 验专业 本科 生我们 要 以 传授分子生物学 中和 临床检验诊 断关系密切 的技术 为主 ， 改善 检验医学专业知识 结构 ， 应新世 纪临 床检验 诊断 的需要 ， 适 同 时启发学生对 生命科 学及疾 病诊 断研究 的热 爱【 。分 子生物 ４ Ｊ 学实验课与其他 实验课 有相 同之处 ， 有其 明显的特 点 ： 又 实验 过程 中的现象与结 果往 往是看 不见 ， 不着 ， 摸 如何 激发学 生 的 学 习兴趣 ， 学生 既体 会到 生命微 观世 界之奇 妙 ， 让 又认 识到分 子生物学实验在 医学检验 的重要性 和实用性 ， 使学 生获得知识 的同时 ， 得到实验技 能的全 面训练 ， 我们在 分子 生物 学实验 是 课教学实践 中不 断努力探索 的动力和方 向。
不论是医院还是企时学生通过课题设计文献查找实验操作结果分析论文撰业用人单位需要的员工不再是只会背书只讲理论的员工而写等实践不但对科学研究的过程有了感性认识而且通过接是动手能力强解决实际问题能力强能够对单位的管理制触使用高尖新的实验仪器设备提高了学生实验技能
第 ３卷 第６ Ｏ 期 ２０ ０ ８年 １ ２月
１ 完 善 实 验 课 整 体 设 计 根据 医学检验本科生教学 以及 分子生物学 技术 的特 点 ， 结
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导分子生物学实验指导动植物检疫专业2012，2分子生物学实验注意事项1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。
实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。
4．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。
在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
6．写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。
7．在实验室内不能大声喧哗。
8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验一质粒DNA的提取1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0 12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
临床分子生物学检验技术实验指导
临床分子生物学检验技术实验指导简介临床分子生物学检验技术是一种在临床医学中应用的分子生物学技术，通过分析和检测个体的基因组、蛋白质组和代谢产物等分子级别的信息，以帮助诊断和治疗疾病。
本文档将指导您进行一系列临床分子生物学检验技术实验，包括基因扩增、基因测序和蛋白质分析等。
基因扩增实验实验材料•反应体系：DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶、缓冲液等•实验仪器：热循环仪、电泳仪等•实验耗材：离心管、PCR管、琼脂糖凝胶、电泳试剂等实验步骤1.准备反应体系：–将PCR管中添加所需的反应体系成分，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将PCR管密封。
2.设置热循环仪参数：–根据扩增反应的需求，设置热循环仪的参数，如退火温度、延伸温度和循环次数等。
3.进行扩增反应：–将PCR管放入热循环仪中，开始扩增反应。
4.等待扩增反应结束：–根据所设定的循环次数，等待扩增反应结束。
5.进行电泳分析：–取出PCR管中的反应体系，加入加载缓冲液，并将其倒入琼脂糖凝胶槽中。
–以合适的电压和时间进行电泳分析。
6.结果分析：–通过电泳图，观察扩增产物带的大小和强度，判断扩增是否成功。
基因测序实验实验材料•反应体系：DNA样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶、缓冲液等•实验仪器：测序仪•实验耗材：离心管、测序管等实验步骤1.提取DNA样本：–从待测样本中提取DNA，使用适当的提取试剂盒进行提取。
2.准备反应体系：–将测序反应所需的反应体系成分，包括DNA 样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将反应体系混合均匀。
3.进行测序反应：–将反应体系转移到测序管中，加入测序仪所需的荧光探针。
–将测序管放入测序仪中，开始测序反应。
4.等待测序反应结束：–根据所设定的反应时间，等待测序反应结束。
5.结果分析：–通过测序仪输出的测序图谱，解读每个碱基的荧光信号，得到待测DNA序列。
分子生物学与分子生物学实验技术大纲
分⼦⽣物学与分⼦⽣物学实验技术⼤纲⼀、绪论1、分⼦⽣物学研究对象：⽣物⼤分⼦的结构（主要是遗传⼤分⼦和功能⼤分⼦）、⽣物⼤分⼦在遗传信息和细胞信息传递中的作⽤2、分⼦⽣物学检验技术的分析对象：病原⽣物基因、基因变异、基因多态性第⼀节真核基因与基因组⼀、真核基因的基本结构1、真核基因结构不连续，为断裂基因2、外显⼦：在基因序列中，出现在成熟mRNA分⼦上的序列3、内含⼦：外显⼦之间，与mRNA剪接过程中被删除部分相对应的间隔序列。
⼆、基因编码区编码多肽链和特定的RNA分⼦1、DNA碱基序列决定特定的成熟RNA分⼦的序列三、调控序列参与真核基因表达调控1、基因的调控区（顺式作⽤元件）：位于基因转录区前后，对基因表达其调控作⽤的区域，因其是紧邻的DNA序列，⼜称旁侧序列。
第⼆节真核基因组的结构与功能基因组：细胞或⽣物体的⼀套完整单倍体遗传物质的总和。
⼀、真核基因组具有独特的结构⼆、真核基因组中存在⼤量重复序列⾼度重复序列、中度重复序列、低重复序列或单拷贝序列三、真核基因组中存在⼤量的多基因家族与假基因1、多基因家族：指由某⼀祖先基因经过重复和变异所产⽣的⼀组在结构上相似、功能相关的基因2、超家族基因：DNA序列相似，但功能不⼀定相关的若⼲个单拷贝基因或若⼲组基因家族总称3、假基因：基因组中存在⼀段与正常基因⾮常相似但不能表达的DNA序列，以来表⽰四、线粒体DNA结构有别于染⾊体DNA五、⼈类基因组有两万多个基因1、基因组⼤⼩⽤C值表⽰，C值⼤⼩基本上反映⽣物进化程度的差异。
2、C值佯谬：⽣物体的进化程度与基因组⼤⼩之间不完全成⽐例的现象六、⼈的基因在染⾊体上的分布特征⾮均匀分布，存在物基因的沙漠区⼆、DNA复制复制：遗传信息从亲代DNA传递到⼦代DNA上复制的三⼤特征：DNA复制从固定的起始位点开始、绝⼤多数DNA复制的双向的、半保留半不连续复制第⼀节复制的基本规律⼀、半保留复制是DNA复制的基本特征1、半保留复制：⼦代DNA双链中的⼀条链来⾃母链，另⼀条链重新合成2、半保留复制意义：遗传稳定性的分⼦机制⼆、DNA复制从起始点向两个⽅向延伸形成双向复制1、原核⽣物复制时，DNA从起始点向两个⽅向解链，形成两个延伸⽅向相反的复制叉，称双向复制2、真核⽣物染⾊体上有多个起始点，是多复制⼦的复制复制⼦：习惯把两个相邻起始点之间的距离定为⼀个复制⼦，是独⽴完成复制的功能单位三、DNA⼀⼦链复制的⽅向与解链⽅向相反，导致半不连续复制1、领头链：顺着解链⽅向⽣成的⼦链，复制是连续进⾏的2、随从链：复制⽅向与解链⽅向相反，不能顺着解链⽅向连续延长，复制是不连续的3、冈崎⽚段：随从链复制中的不连续⽚段4、半不连续性：领头链连续复制⽽随从链不连续复制第⼆节复制的酶学与拓扑学变化⼀、核⽢酸与核苷酸之间⽣成磷酸⼆酯键是复制的基本化学反应⼆、DNA聚合酶催化核苷酸之间的聚合1、DNA聚合酶活性：5'→ 3'的聚合活性、核酸外切酶活性（5'→ 3'外切酶活性：切除引物，切除突变⽚段；3′→5′外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其⽔解）2、DNA聚合酶：原核⽣物：DNApolⅠ、Ⅱ、Ⅲ；真核⽣物：DNA-pol α、β、γ、δ、ε…3、DNA-polⅠ：对复制中的错误进⾏校读，对复制和修复中出现的空隙进⾏填补4、DNA-polⅡ：发⽣突变，依然能存活，参与DNA损伤的应急状态修复5、DNA-polⅢ：是原核⽣物复制延长中真正起催化作⽤的酶三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据四、复制中的分⼦解链伴有DNA分⼦拓扑学变化1、解螺旋酶：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链2、拓扑异构酶：既能⽔解⼜能连接磷酸⼆酯键；TopoⅠ：不需ATP，切割双链DNA中的⼀链，使DNA松弛后, 连接切⼝TopoⅡ：切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分⼦成负超螺旋再连接切⼝3、单链DNA结合蛋⽩：防⽌单链DNA重新形成双链，防⽌单链DNA被核酸酶⽔解4、引物酶：催化RNA引物合成的酶5、引发体：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域五、 DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺⼝1、DNA连接酶：催化DNA双链的3’羟基和相邻的5’磷酸基团形成磷酸⼆酯键，从⽽把两段相邻的DNA链连成完整的链第三节原核⽣物的DNA⽣物合成⼀、复制起始：DNA解链形成引发体1、DNA解链成单链由特定蛋⽩质识别复制起始位点，在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋⽩的共同作⽤下，DNA解链，解旋，形成复制叉2、引发体的⽣成解螺旋酶解开双链后引物酶进⼊形成引发体3. RNA引物的合成⼆、复制延长：领头链连续复制，随从链不连续复制引物合成后，由DNA polⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶δ和α)催化，按碱基配对原则，将dNTP 逐⼀添加到引物3'末端，形成磷酸⼆酯键，使新合成的链不断延长三、复制终⽌：切除引物、填补空缺、连接切⼝1. 原核⽣物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终⽌点。
《分子生物学检验技术》实验指导
实验一小鼠肝组织DNA的提取及鉴定【实验目的】1、掌握动物组织DNA提取的方法；2、掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。
本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。
分子生物学实验技术与操作规范
分子生物学实验技术与操作规范分子生物学实验技术与操作规范是在分子生物学实验中必须遵循的一系列准则和步骤。
这些规范旨在确保实验的准确性、可重复性和安全性。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术和操作规范。
一、引物设计与合成引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短寡核苷酸序列。
引物的设计应遵循以下原则：引物长度应在18-25个碱基对之间，GC含量应在40-60%之间，避免引物间的互补性和自身互补性。
合成引物时应选择可靠的供应商，并进行质量检测。
二、核酸提取核酸提取是从生物样本中提取目标DNA或RNA的过程。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商用试剂盒法。
在进行核酸提取前，必须严格遵守实验室的安全操作规范，佩戴手套和口罩，避免污染。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA片段的技术。
在进行PCR反应时，应注意以下几点：准备反应液时要避免污染，使用无菌的试剂和器具；设置阳性对照和阴性对照以验证实验结果的准确性；选择合适的PCR条件，包括温度和时间参数。
四、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA或RNA片段的方法。
在进行凝胶电泳前，应先准备好琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。
电泳时要注意以下几点：将样品加入凝胶孔中时要避免气泡的产生；设置适当的电压和电泳时间以获得清晰的电泳带；使用DNA分子量标记物来确定目标片段的大小。
五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
在进行蛋白质表达时，应选择合适的宿主细胞和表达载体，并进行优化实验条件。
在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。
在进行蛋白质表达与纯化实验时，应注意操作的无菌性和安全性。
六、基因克隆基因克隆是将目标基因插入到载体中的过程。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割、连接反应和转化。
在进行基因克隆实验时，应注意以下几点：选择适当的限制性内切酶和连接酶，并进行酶切和连接的优化实验；使用无菌的试剂和器具，避免污染；进行正反向测序以验证插入的正确性。
分子生物学检测技术要求与质量控制
实验室空间 实验室空间应定期进行紫外照射。 实验台面和仪器设备的清洁 实验台面、超净工作台宜用3%双氧水或10%次 氯酸钠溶液（含有效氯1 g/L）擦拭清洁；也可在擦 拭后再用紫外光照射，照射距离应不超过90 cm， 照射时间宜过夜。
实验室质量控制和质量保证
－ 有毒有害及废弃物质的处理
实验室质量控制和质量保证
－试剂要求
除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不 含DNA、DNase和RNase的分析纯或生化试剂。 实验用水应符合GB 6682-92中一级水的规格。去 离子水的电阻应达到18.2 。 商品试剂盒应注明到货日期，对所收到的试剂盒 应按规定的贮存条件存放。
实验室质量控制和质量保证
蛋白质检验区
— 功能及要求
蛋白质分离纯化区
主要功能：用于蛋白质的分离与纯化。 工作区域要求：蛋白质纯化应具备低温 工作的场地，如4℃冷房和/或层析柜等。
蛋白质分离纯化区
主要功能：蛋白质分析检测
control
test
阳性结果
阴性结果
检测工作流程
实验室样品到样验收（确定是否具备检验的基 本条件） 混样 获取测试样品à测试样品的制 备（待检状态） 的提取 验报告） 核酸和/或蛋白等目标物质 PCR实验（包括扩增和产物分析）和
－试剂配制
实验室配制的试剂应在容器上标明试剂名称、浓度、 配制时间、保存条件、失效日期及配制者姓名。 所用试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭 菌保存，不宜高压灭菌的试剂应过滤（0.22 µm） 除菌；PCR主混液、引物、探针应避免反复冻融。
实验室质量控制和质量保证
－试剂配制
实验室应确定关键试剂，并在使用前进行质量 检测。关键试剂包括：核酸提取试剂、RNase、 蛋白酶K、阴性对照标准物质、阳性对照标准 物质、Taq酶、各种限制性内切酶、引物、探针、 菌种、阳性质粒。 试剂质检包括①有无污染，是否存在假阳性； ②使用弱阳性对照标准物质检测试剂的扩增效 果。
分子生物学实验指导-1
第一部分分子生物学实验入门一、实验室规则（一）实验室安全规则1．水电使用安全规则：注意节约用水（不管是自来水还是纯净水），清洗器皿时，先用自来水洗干净后，根据实验需要再用纯净水冲洗l～3遍；随时注意水龙头是否关掉，水池是否堵塞、漏水；注意节约用电，不能随意调节空调，仪器使用前应了解是否漏电、短路，使用完后按操作程序关掉电源；最后离开实验室的同学应检查实验室的照明灯、仪器电源、水龙头是否关掉。
2．药品使用安全规则：易燃易爆药品远离火源；注意有毒或腐蚀性药品—的使用方法；绝对禁止药品、试剂间的相互污染；废弃液体入水池后用水冲掉，固体废弃物严禁入水池；有毒废弃物倒到指定地点。
3．仪器使用安全规则：实验室任何仪器不能随意操作，严格按照操作规程进行；仪器在使用过程中出现故障要报告，不能自行处理；使用完仪器后要清洁仪器和台面并记录仪器使用情况。
（二）实验室卫生规则1．维护实验室的清洁卫生：不能随地吐痰，乱扔废纸屑等物品。
每小组实验完后清洗器皿和清理台面。
2．严格执行卫生值日制：实验完后实验室的清洁卫生由值日小组按照布置严格执行，不能无故不做。
（三）学生守则1．每位同学都应衣冠整齐，自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不得无故迟到早退，保持室内安静。
2．注意实验室环境、仪器和实验桌面的整洁，每次实验完成后该清洗的器皿清洗完后按原位放好，经老师检查后方可离开。
3．每次开始做实验前，应预习好实验指导，要充分了解实验原理、方法及仪器设备的使用方法，原则上按照实验指导的方法进行，如经预习，查资料后，有更好的实验方法，可与老师讨论后进行，鼓励创新。
4．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂。
5．注意安全。
易燃易爆物远离火源，注意有毒或腐蚀药品的使用方法，玻璃器皿的使用、洗涤，尽可能减少损坏、割伤手。
行走时不要碰撞他物。
废弃液体倒入水槽并用水冲走，固体废弃物严禁入水槽，应丢入垃圾桶中。
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《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】把握动物组织DNA提取的方法；把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。
本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。
将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。
2、提取DNA（1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。
（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。
（3）加入1/3体积的Buffer PP，涡旋震荡20 s，12000 rpm离心3 min。
（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。
12000 rpm离心1 min，弃上清。
（5）加入300 μl 70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。
12 000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。
（6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温储存待测。
3、DNA浓度和纯度的测定取0.1 ml DNA样品，加蒸馏水至1 ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。
运算：DNA浓度（μg/ml）= A260×50×10 （请咨询系数50、10是如何得来的？）DNA纯度= A260nm/A280nm【注意事项】（1）由于DNA要紧存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破裂要严格操纵好。
即要尽可能的将细胞膜破裂，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。
为幸免D NA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。
在提取过程中，染色体会发生气械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温顺的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。
（2）用氯仿除去组织蛋白，要持续振荡使蛋白质变性。
如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。
（3）酚和氯仿均有专门强的腐蚀性，操作时应幸免接触皮肤。
（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会阻碍内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA 完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。
（5）提取过程应尽量保持低温。
（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DN A浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。
据此来运算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。
（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。
应按照后续实验要求，采取不同的方法纯化。
因此也会显现D NA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情形，因此有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。
【结果】1、A260 = ，A280 = 。
2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。
3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。
【摸索题】提取和纯化的真核组织DNA有何用途？你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？实验二聚合酶链反应【实验目的】采纳聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因【实验原理】聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。
其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。
反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分不与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之咨询。
PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。
反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。
反应混合液被加热以使模板DNA 双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。
当温度升至7 2℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5 ‘向3’方向持续延伸，直至形成新的DNA双链。
通过变性、退火和延伸的一个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加一倍。
由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板通过n个循环可得2n个分子拷贝产物。
本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。
扩增所用的上游引物序列为：5’-AGT TATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。
【实验器材和试剂】1、设备PCR仪、0.2ml PCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。
2、试剂（20 μl体系）PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）【操作步骤】分不在PCR反应管中加入2×PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。
把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。
本实验的扩增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。
重复35个循环后，于72℃再延伸10 min，最后4℃保温。
反应终止后，将PCR反应管于12000 rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。
【注意事项】1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。
因此，必须采取相应措施幸免发生污染。
2、PCR实验应当设置阴性对比反应，即在反应体系中不加模板DNA。
3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于P CR管中，然后再在各管中分不加入模板。
4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。
PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。
5、PCR试剂与模板DNA及样品应分不储存于不同功能区的冰箱中。
6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分不使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。
【结果】【摸索题】PCR各组分在反应中的作用是什么？降低退火温度、延长变性时刻会对反应有何阻碍？实验三琼脂糖凝胶电泳【实验目的】把握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
【实验原理】带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用专门广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
D NA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也能够分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA 分子。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，一般琼脂糖凝胶分离DNA的范畴为0.2-20kb，其辨论率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范畴广。
荧光染料溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照耀下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。
由于E B是致癌剂，现在开发出了安全的染料，如Syber Green、GelRed、GoldView等。
【仪器与试剂】1. 仪器天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。
2. 试剂（1）50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242.0g、冰乙酸57.1 ml、E DTA 63.5g、NaOH 10.0g，加蒸馏水至1000 ml，使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。
（2）6×loading buffer ：( 0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25％溴酚蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液），贮存于4℃。
（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液: 将EB 配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNA Marke r、DNA、蒸馏水。