03 第三章 DNA的复制

SV40病毒染色体有一个约400bp的无核小体区，其 中64bp为复制核心起点。
(1) 不完全回文序列（15bp)； 核心起点按5’-3’方向依次为 (2) 4个GAGGC反向重复序列； (3) 富A/T序列。
3) 复制起点基本特征： 1. 它们都是由多个独特的短重复序列组成的。 2. 这些短重复序列被多亚基的复制起点结合蛋 白识别。 复制起点附近一般有一个富AT序列。
dCTP
腺病毒的DNA复制
（五）复制的几种方式 1.线性DNA的复制 • 单一起点单向（腺病毒）、单一起点双向（T7 噬菌体）、多起点双向。 2.环状DNA的复制 • θ型 • 滚环型 • D-环型
θ型复制
滚环型复制
线粒体DNA的复制 （D-环复制）
（六）参与DNA复制的酶 1.解旋酶 2.单链结合蛋白 3.引发酶 4. DNA聚合酶 5. DNA拓扑异构酶 6.连接酶
第三章 DNA的复制 的复制 DNA replication
本章内容安排
第一节、DNA复制的概况 第二节、原核生物的DNA复制 第三节、真核生物的DNA复制 第四节、复制的忠实性 第五节、 DNA复制原理的应用
第一节、DNA复制的概况 第一节、DNA复制的概况
一、核酸生物合成的一般规则 1. 绝大多数DNA或RNA生物合成，均按照 Watson-Crick碱基互补 碱基互补原则，以拷贝预先存在 碱基互补 的DNA链（模板链）的方式进行。 2.核酸链合成的方向只有一个：5’→3’。 3.特异的聚合酶 特异的聚合酶催化合成DNA或RNA。 特异的聚合酶
是利用ATP的化学能，使亲本DNA双链在复制叉分离 成单链的酶。 Dna B 蛋白是E.coli主要负责在复制叉解旋的酶。 DnaB蛋白在E.coli复制起点具有双重功能： 5’→3’解旋酶功能； 结合引物酶，并激活引物合成。
DNA解旋酶分离双螺旋的两条链
（二）单链DNA结合蛋白 （Single-Strand DNA-Binding Proteins，SSBs） SSB蛋白的作用：
1. DNA聚合酶I（Pol I）： 是一个102kD的多肽链。具有三种酶活性： DNA聚合酶活性 3’→5’核酸外切酶活性 5’→3’核酸外切酶活性
• DNA聚合酶活性： 延伸能力不强，每次结合仅能添加20-100个核苷酸。
3’ → 5’核酸外切酶活性：
• 切除DNA复制过程中 的错配碱基： Pol I 利用3’-5’核酸外 切酶活性将DNA复制 过程中的错配碱基切 掉，同时将正确的碱 基加上去。
1. 主要起稳定作用，防止单链DNA重新退火形成双螺旋 2. 防止单链DNA 降解 3. 对它们的同源DNA聚合酶具有激活作用
• SSB蛋白以正协同相互作用的方式结合于DNA单链区， 在E.coli DNA复制的不同阶段均起重要作用。
SSB与DNA的结合
（三）引物酶（primerase）：
在DNA复制中，催化RNA引物合成的特殊的RNA聚合 酶叫引物酶。
5’ → 3’核酸外切酶活性：
1) 切除受损伤部位DNA：
Pol I的5’ → 3’核酸外切酶 活性从损伤部位5’端切口处 切除受损伤DNA 并填补所 形成 的缺口。
2) 切除RNA引物：
在生理条件下， Pol I的5’ → 3’核酸外切酶活性会切 除新合成DNA 5’端的RNA 引物和填补所形成 的缺口。
腺病毒的DNA复制
（2）一个起点，一个复制叉，单向复制。 两条链的复制起点在同一位置，复制叉向一个方 向运动，两条DNA链均被拷贝。如E.coli的colE1 质粒的复制。
E.coli的ColE1质粒的单向复制
EcoRI
（3）一个起点，两个复制叉，双向复制。 复制起始于一个位点，形成两个复制叉，向相反方 向运动。在每个复制叉，两条DNA链均被拷贝。
二、DNA复制的基本特征（多数生物）
（一）DNA的半保留复制 1.半保留复制定义： 就是说，DNA复制必须 以一条母链为模板以碱基互 补的原则合成新的DNA链， 即新合成的DNA双螺旋由一 条母链和一条新合成的子链 构成。
2. DNA半保留复制假说的提出及证实： 1) DNA的双螺旋结构
2) 三种DNA复制假说：
3.复制子(replicon)： 一般把生物体的复制单位称为复制子，即从一 个DNA复制起点起始的DNA复制区域。它是 一个独立复制单位，包括复制起点和终点。每 个复制子有一个复制起点。
原核DNA为单复制子，而真核生物的染 色体为多复制子。
根据染色体DNA的长度、复制所需要的时间和复制子 的数目，可以计算出DNA复制的速度：
免疫学信息网
3) 实验证据：
Meselson and Stahl
They experimentally proved Watson and Crick’s model of semi-conservative replication
Meselson和Stahl的实验： 和 的实验： 的实验
1972年，Fareed等发现， 正在复制的SV40 DNA 经过EcoRI水解后，在 电镜下发现若干大小不 等的复制泡，其中心到 两端的距离恒定，提示 SV40 DNA复制为一个 起点，两个复制叉反方 向运动进行复制
在生物界，复制叉移动的方向和速度虽是多 种多样的，但以双向等速方式为主。
（三） 半不连续复制
3.
对一个生物体基因组而言，复制起点是固定的。
2. 复制叉
1) 复制叉(replication fork)：
在DNA分子中正在复制的部位结构呈Y型或叉型， 故称之为复制叉。
2) 复制眼（replication eye）： DNA的正在复制的部分在电镜下观察起来犹如 一只眼睛，称为复制眼。
Transmission electron micrograph of human DNA from a hela cell, illustration the replication bubble that characterizes DNA replication within a single replicon. (Dr. Copal multiscience photo library/photo researchs, Inc)
引物 OH
引物的主要形式是RNA。少量病毒DNA复制以DNA或核甘 酸为引物。 • 1.RNA引物 引发（priming） ：所有细胞和很多病毒的DNA复制，必 须首先在模板上合成一小段RNA引物，这一过程就引发。
• 2.DNA引物： 如噬菌体DNA的滚环复制。
• 3.核苷酸引物： 如腺病毒的复制。病毒DNA的5’端磷酸基团和一个特殊的 蛋白分子Ser侧链共价结合（末端蛋白）。该蛋白与 dCTP结合作为DNA合成起始的引物。
Байду номын сангаас
E.coli染色体长4.4×106bp 完成复制一般需要约42分钟 有一个复制起点两复制叉 DNA的合成速度（或每个复制 叉的运动速度）约为1000bp/s。
4. 复制方向
• 在DNA半保留复制过程中，DNA链的合成 主要有以下三种方式： （1）两个起点，两个生长端，相向复制。 这种方式最为简单，某些线性DNA病毒（如 腺病毒）就是通过这种方式进行复制。不能 形成典型的复制叉。
Three replication hypotheses
（二）复制的起点、方向和速度 1.复制起点：
1) 定义： 指DNA复制起始所必需的一段特殊的DNA序列。 2) 几种生物复制起点的组成：
E.coli 的oriC组成：
3个同向重复的13bp序列 两种类型的重复序列 4个反向重复的9bp序列 富含A-T
引物酶不需要特殊DNA序列来起始合成，只有与DNA解 旋酶等结合时才被激活。E.coli的引物酶是DnaG蛋白。
DNA复制是随模板上RNA引物的合成开始的。RNA引 物长度一般为11-12个碱基。
（四）DNA聚合酶（DNA Polymerases） • E.coli中至少有5种DNA聚合酶。DNA聚合酶I 和III都与DNA复制有关，另外3种酶特别用于 DNA修复。
酵母的自主性复制序列（autonomous replication sequence，ARS）：
共有序列（A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) 功能域A 是ARS的核心，可能是起始蛋白结合位点 两个功能域 富含AT，延伸到核心序列3’端50-100bp 处 可能是DNA熔解的区域
功能域B
SV40病毒：
切口位移（nick translation）： 切口位移 细胞中存在多种DNA修复系统， 它们的核酸外切酶活性会在 DNA受损伤部位的5’端进行切 割产生切口，后者就激活Pol I 的5’ → 3’核酸外切酶活性，从 而切除DNA的受损伤部位， Pol I的聚合酶活性使DNA链向 3’端延伸，这称为切口平移。
三、DNA复制的一般模型
1. 双螺旋DNA分子解旋 2. RNA引物合成 3. 前导链和滞后链的合成
4. RNA引物降解及缺口补齐 5. 新合成的DNA片段连接在一起
第二节、 原核生物的DNA复制（E.coli） DNA复制 第二节、 原核生物的DNA复制（E.coli）
一、DNA复制的酶
（一）解旋酶（Helicase）
因为DNA聚合酶只能从5’→ 3’的方向合成DNA，所以， 新合成的DNA链只能有一条是连续合成的（前导链，the leading strand），而另一条则是不连续合成的，即由多个 新合成的DNA片段连接而成（后随链，the lagging strand）。
• 前导链（leading strand）：在DNA复制时，一条链的合 成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续合成，其合 成总是比另一条链超前一步，称为前导链。
• 后随链（lagging strand）：DNA复制时，一条链的合成 方向和复制叉前进方向正好相反，不能连续合成，且总 是比另一条链滞后一步，称为后随链。