仪器分析原理4-1分子发光分析法

荧光光谱具有如下特性： ① 斯托克斯位移： 由于振动驰豫而损失了能量，所以
荧光波长大于激发光的波长。 ② 荧光光谱的形状与激发光波长无关，分子的吸收谱可
能有几个吸收带，但是荧光光谱只有一个发射带—从 第一激发态的最低振动能级回到基态，所以荧光光谱 和激发波长无关。 ③ 镜像对称：有些物质的荧光光谱和吸收光谱之间存在 “镜像对称”关系。
(2) 分子为刚性的平面结构 平面刚性结构可以减少分子自身的振动，使分子与溶 剂或其它溶质刚性的平面结构的相互作用减少，降低 了碰撞去激发的可能性，有比较强的荧光。
O
O
OO
O
C COO
C COO
荧光黄 发荧光 酚酞 不发荧光
H3C CH3
CH 2OH
萘
荧光强
维生素A 荧光弱
(3) 取代基效应 苯环上不同的取代基及取代基位置对该化合物的荧光 强度和荧光光谱有较强的影响。 △ 给电子取代基加强荧光 如: –NH2、–NHR、–NR2、–OH、–OR、–CN等； △ 得电子基取代基一般将使荧光减弱，使磷光加强 如: 羰基(＞C=O、–COOH、)，硝基(−NO2)和重氮 基等； △ 重原子取代，即卤素取代，芳烃取代上卤素之后， 其化合物的荧光随卤素原子量增加而减弱，而磷光 则相应地增强。
度随反应时间增加而迅速下降
(如图)，定量以峰值(或总的发
光强度)与被分析物的浓度成线
性关系。
时间
2. 化学发光反应类型 (1) 气相化学发光 气相化学发光反应主要有O3、NO
和S的化学发光反应。可以用于监测空气中的O3、 NO、NO2、H2S、SO2 和CO等。 (2) 液相化学发光 用于液相化学发光的物质有鲁米诺 (Lominol)、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧化草 酸盐、硅氧烯和芳香游离基离子等。
而增加两者之间的碰撞频率，使外转换去激过程增大。 在低温条件下，荧光强度有显著增强。
3. 溶液的pH影响： 溶液的pH值主要影响荧光物质存在的形式， 所以
要严格控制溶液的pH值。 4. 内过滤作用和自吸现象：
溶液中存在一种吸收荧光的物质，起着滤光片的作 用，使荧光强度减弱。又称为自吸收。
§4.2.6 荧光猝灭 引起荧光强度降低，称为荧光猝灭，使荧光强度下降的 物质称为猝灭剂。
此过程发生在生物体系中就称为生物发光。
1. 化学发光的基本原理
化学发光过程可以用下述反应式表示：
A + B → C* + D
化学激发
C*→ C + hυ
化学发光
化学发光反应的要求: (1) 反应应提供足够的激发能（150~ 300 KJ ·mol–1）， 并且具有一定的速度，大多数氧化还原反应满足上述 条件, 所以化学发光反应多是氧化 还原反应。 (2) 反应过程中至少一种激发态分子产生，芳香族化合 物和羰基化合物容易生成激发态产物。 (3) 激发态分子不能以热的形式消耗能量，只能以释放 光子的形式回到基态。
分子发光分析法
§4.2 分子发光分析法
分子荧光
分 分子磷光 本节主要讨论内容 子 发 化学发光 光
生物发光
散射发光-激光拉曼光谱法
§4.2.1 分子荧光和分子磷光的产生
每种物质分子都具有一系列紧密相隔的电子能级，而每 个电子能级又包含一系列的振动能级和转动能级。当分 子吸收能量(电能，热能，光能或化学能等）可跃迁到激 发态。分子在激发态是不稳定的，很快跃迁返回到基态。 在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射 出来，这种现象称为“发光”。
§4.2.5 影响荧光强度的因素
1. 溶剂的影响 取决溶剂分子和荧光分子的相互作用，作用不同，
效果完全不同。 非极性荧光物质：溶剂的极性↑→荧光强度↑， 而荧光峰位红移； 极性荧光物质：溶剂的极性影响偶极矩，效果完全 相反。
2. 温度对荧光强度的影响： 荧光强度对温度很敏感，温度↑→荧光强度↓ 温度升高增加了荧光分子和溶剂分子的热运动，从
△ 取代基位置：对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制 荧光。
△ 含氮杂环化合物：杂环化合物分子有N、O、S原子(非键 电子n)，激发跃迁属n–π*类型，吸光系数小；在低温和 极性溶剂中有较强的磷光； 溶剂的极性↑→荧光强度↑
2. 无机物的荧光-----比较简单 (1) 无机盐的荧光： 一般 镧系元素的三价离子和锕系元
§4.2.2 荧光激发光谱和荧光发射光谱 1. 荧光激发光谱(荧光激发波长的选择) 以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，绘制 激发光谱曲线；当荧光强度最大所对应的激发波长即 为最适宜的激发波长。 2. 荧光发射光谱(荧光或磷光发射光谱) 选定激发波长后，测定不同波长下的荧光(磷光)强度， 即得到荧光(磷光)发射光谱。
化学发光定量分析的依据：
Ic (t) = c (dCA/dt)
式中的Ic (t)表示在反应进行到t时的化学发光强度；
c为化学发光效率，它与特定的化学发光有关；
(dCA/dtБайду номын сангаас为分析物A参加反应的速率。
如果反应是一级动力学反应, 化
学发光强度与同一时刻的分析
化学发光强度
物A的浓度成正比; 化学发光强
其中 kf取决于分子的化学结构, 而Σkj取决于分子所处的化 学环境。若kf＜＜Σkj时，即使该物质具有很大吸光系数， 也不会产生荧光(磷光)。
1. 有机化合物的荧光(三类有机化合物具有强荧光) (1) 具有较大的共轭π键 共轭体系越大, π键电子非定域(即流动性)越大, 越容易被激 发，荧光也越容易发生。所以芳环或杂环化合物有较强的 荧光，芳环越大，荧光强度也越强 。
根据荧光参数不仅可以定量分析，还可以进行定性分析。
§4.2.4 荧光和分子结构
荧光分子的结构特点： ① 对激发光具有强吸收； ② 荧光发射的速率比其它非辐射跃迁速率大，即荧光量 子产率大，可用各个跃迁过程的速率常数表示荧光的量子 产率：
kf
kf Σ kj
(kf为荧光发射的速率常数，Σkj为其它各过程的速率常数之和)
能量略低些。
2. 去激过程：去激有辐射跃迁和非辐射跃迁 辐射跃迁：放出的光子是荧光或磷光； 非辐射跃迁：振动驰豫、热驰豫(内转换, 外转换、 系间跨越等) 跃迁方式与物质分子结构有关，也和激发时的物理 和化学环境等因素有关。
3. 分子荧光的产生 分子从激发单重态的最低振动能层发生S1→S0跃迁回到 基态放出光子，去激发过程在10−9~10–7 s 左右的时间内。
§4.2.3 分子荧光参数
1. 荧光强度I (某特定荧光波长的强度) 荧光强度I 和荧光物质的浓度成正比，这是荧光定量分
析的基础。
I Kφf IeClε φf
式中K为仪器的常数, Ie为激发光的强度,ε为荧光物质的 吸收系数, C为荧光物质的浓度, l 为吸收光程, 为荧光 的量子产率。
f
发射的光子数 吸收的光子数
1. 分子的多重性 根据泡利不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子自
旋方向相反，即自旋配对，自旋量子数的代数和s = 0, 其 分子态的多重性M = 2s+1 = 1，该分子处在单重态，用符 号S表示。
(1) 绝大多数有机分子的基态是单重态, 分子吸收能量后,
自旋方向不变，则分子处在激发单重态。S0, S1, S2分 别表示分子的基态，第一和第二激发单重态。 (2) 如果跃迁到高能级的过程还伴随着电子自旋方向的改 变，此时分子具有两个不配对电子(s=1)，则M=3，分 子处于激发三重态，用符号T来表示。T1和T2分别表 示分子的第一和第二激发三重态。 (3) 根据洪特规则，平行自旋比配对自旋更稳定。因此分 子的激发的三重态的能级总是比相应的激发单重态的
(3) 生物发光分析 生物发光反应常涉及到催化反应和发光反应。这类反
应选择性很好，而且有很高的灵敏度。
三磷酸腺苷(ATP)的测定就是一个十分成功的实例。在 pH7~8的介质中，在荧光素酶(E)和Mg(Ⅱ)的存在条件 下，让荧光素(LH2)与ATP反应，生成磷酸腺苷(AMP) 荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐。
素中的 铀的无机盐有荧光，是由5d电子或 4f电子跃迁而 发射的，谱线比较窄；
(2) 不发荧光的无机离子和有吸光结构的有剂机试剂进 行配合反应，将n→π* 跃迁变为π→π*，使有机配合体的 非刚性→为刚性的结构→荧光 配位化合物。如8-羟基喹啉， 罗丹明类染料是常用的金属离子显色剂。
另外，二元配合物和三元配合物的产生荧光的详细情 况可自学看书。
入了三重态后在常温下不发荧光。有些条件会诱变使荧 光分子从单重激发态向三重激发态跃迁，而使荧光猝灭。
4. 荧光物质的自猝灭 在高浓度的荧光物质溶液中，荧光强度因其浓度高
而减弱称为自猝灭（碰撞 ）。如蒽和苯的自猝灭便是其 例。
§4.2.7 化学发光和生物发光分析
受化学能的激发，使分子处在激发态，称为化学发光；
所以，在条件一定时，荧光强度仅与荧光物质浓度成正比。
2. 荧光总量 指荧光光谱在所有波长处的荧光强度之和。用荧光
光谱的面积来表示荧光总量。利用荧光总量来进行荧光 定量分析，可以提高方法的灵敏度。
3. 荧光寿命τ 荧光强度降到最大强度的1/e所需要的时间，常用τ
表示。一般t =τ时已有63%的受激分子已衰变了。不同 的荧光物质荧光寿命不同，所以，可以利用荧光寿命的 进行荧光混合物分析。
4. 分子磷光的产生 分子从激发三重态的最低振动能层,发生T1→S0 , 跃迁
回到 基态放出光子，去激过程在10−4～10 s 左右的长时 间内。
所以荧光和磷光的区别是： (1) 荧光是由激发单重态最低振动能层跃迁到基态的各振
动能层的光辐射，而磷光是由激发三重态的最低振动 能层跃迁到基态的各振动能层所产生光的辐射 (2) 三重激发态能级总是比相应的单重态激发态的能量 低，所以一般磷光波长较相应的荧光波长长。