红锥ISSR—PCR扩增体系的优化

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中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选

中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选作者：黄晓慧巫伟峰陈春张毅智汪长水徐建球陈发兴陈孝丑来源：《南方农业学报》2018年第07期摘要：【目的】优化中国兰的ISSR-PCR反应体系，并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物，为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考。

【方法】以6个中国兰品种为材料，采集其叶片样品，分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化，建立最佳ISSR-PCR 反应体系，并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物。

【结果】研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法，但二者提取的DNA质量均较好（OD260/OD280为1.7～2.0）。

对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量。

综合考虑成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反应体系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。

最佳循环数为35，最佳退火温度为49.6 ℃。

基于上述优化结果，从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物。

【结论】研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。

关键词：中国兰；ISSR；分子标记；反应；引物筛选中图分类号： S682.310.36 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1282-070 引言【研究意义】中国兰又称国兰，是中国传统兰花的统称，为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美称，且具有独特的内涵和意境，观赏和经济价值很高（陈心启，2011）。

银杏ISSR_PCR扩增反应体系的建立与优化

银杏（Ginkgo biloba ）是我国特有的珍贵树种，被称为“活化石”。

该树种属于裸子植物，雌雄异株，具有重要的经济和科学研究价值。

分子标记是以核酸多态性为基础的遗传标记，它的本质是反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特征性DNA 片段[1]。

近年来，基于PCR 的分子标记技术得到了发展，其中包括随机扩增多态DNA （RAPD ）[2]、扩增片段长度多态性（AFLP ）[3]及简单序列重复区间（ISSR ）[4]，它们已经被成功地用于很多植物种属的基因型分型、基因组图谱和系统发生的研究[5－7]。

RAPD 对实验条件过于敏感，因而限制了其应用。

AFLP 技术是基于基因组限制性片段的选择性扩增，其缺点是对DNA 的质量要求很高。

微卫星SSR （simple sequence repeats ，简单序列重复）银杏ISSR－PCR 扩增反应体系的建立与优化徐奭1，张耀川2，李树成1，姚涛1，牛振刚1，陈文俐3，白素兰11．首都师范大学生命科学学院，北京100048；2．北京农业职业学院园艺系，北京102442；3．中国科学院植物研究所，北京100093［摘要］目的：为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析，建立银杏ISSR－PCR 的最佳扩增反应体系。

方法：采用正交设计和单因素梯度实验，对影响ISSR－PCR 反应体系的5个主要因素（Mg 2＋、dNTP 、引物、模板DNA 及Taq DNA 聚合酶）进行筛选及优化。

结果：银杏25μL ISSR 最佳扩增反应体系包含10×Taq 反应缓冲液、2．5mmol ／L MgCl 2、0．45mmol ／L dNTP 、1．2μmol ／L 引物（UBC861）、10ng 模板DNA 及0．9U Taq DNA 聚合酶，使用此ISSR 扩增反应体系，获得了10株不同性别银杏DNA 的清晰条带，验证了该体系的稳定性。

结论：优化的反应体系为采用ISSR 分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。

优化pcr体系的方法

优化pcr体系的方法
优化PCR体系的方法有：
1. 优化引物设计：选择合适的引物序列，优化引物的浓度和比例，确保引物的特异性和互补性。

2. 优化反应条件：合理调整PCR反应的温度、时间和环节，比如优化退火温度、延长扩增时间等，以提高反应效率和特异性。

3. 优化酶的选择：选择适合的DNA聚合酶和其缓冲液，以提高PCR反应的效率和特异性。

4. 添加辅助物质：如DMSO、BSA等，可以改变反应体系的离子平衡，降低引物间的二级结构，增强PCR效果。

5. 优化反应体系中其他组分的浓度：如优化模板DNA、引物和dNTP等的浓度，以提高PCR反应的效率和特异性。

6. 引入热启动酶或热稳定酶：可以在PCR反应开始前抑制非特异性扩增，提高PCR的特异性。

7. 优化反应体系的pH值：调整PCR反应的pH值，使其适合DNA的变性和扩增过程。

8. 引入分析验证环节：如添加内参物质或设计阳性对照，进行验证实验，检测PCR反应的特异性和准确性。

9. 优化PCR反应后处理：如优化PCR产物的纯化方法、提高PCR产物的检测灵敏度，以提高PCR实验的质量和效果。

应用均匀设计优化文冠果ISSR-PCR反应体系

应用均匀设计优化文冠果ISSR-PCR反应体系张芸香;刘晶晶;白晋华;郭红彦;郭晋平【摘要】采用均匀设计,对引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP 浓度4个因素分别设置5个水平,对文冠果ISSR-PCR反应体系进行优化,在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测,构建了文冠果ISSR-PCR优化反应体系,在20 μL ISSR-PCR反应体系中,各因素的最佳浓度分别为:2×PCR buffer、0.2mmol·L-1dNTP、0.3μmol·L-1引物、2.5 mmol·L-1Mg2+和0.4 U TaqDNA聚合酶,进一步对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min,接着进行40个循环:94℃变性35s,52～56℃退火35 s,72℃延伸45 s;循环结束后,72℃延伸10 min.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】5页(P241-244,248)【关键词】文冠果;ISSR-PCR;均匀设计【作者】张芸香;刘晶晶;白晋华;郭红彦;郭晋平【作者单位】山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q943.2文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge.)属无患子科文冠果属，落叶乔木和灌木，广泛分布于我国北方荒山坡地、沟谷间和丘陵地带，有较强的适应性和抗逆能力，根系发达、根蘖能力强，是优良的水土保持树种、园林绿化树种、蜜源植物和生物质能源树种[1，2]。

文冠果人工栽培的时间并不长，目前仍处于野生和半野生的状态。

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【摘要】22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),2μL 10×PCRBuffer(mg2+ plus),1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L),1.5 μL引物(10 pmol/μL),50 ng模板DNA,ddH2O补足体积.以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条.引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃.12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81％.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】7页(P1-6,11)【关键词】虉草;ISSR-PCR反应体系;引物筛选【作者】张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【作者单位】内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042【正文语种】中文【中图分类】S543;Q786虉草(Phalaris arundinacea)，属于禾本科(Gramineae)、虉草属植物，别名草芦、园草芦。

主要分布于欧洲、北美和亚洲，在我国主要分布于东北、华北、华中、华东等地区。

虉草耐盐碱、耐湿涝，又耐旱，生长快，营养繁殖能力强，产草量高、叶量丰富，蛋白质含量高，被广泛用于饲草、人工湿地植物、生物能源材料或造纸原料等[1-2]。

红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

ｓｓｅ，Ｔａｎｙｙｔｍｑｅｚｍｅ，０．５Ｕ・Ｌ一，０Ｍ
２．０ｍｍｏｌ・Ｌ～ｔｍｐａｅＤＮＡｇ ‘Ｌ～，ＮＴＰ．ｅｌｔ１ｎｄｓ０３ｍｍｏｌ・Ｌ～，ｒｍ— ｐｉ
ｅ（３）０５ｐｎｌＬｒ８５．ｊｏ・～，ｎＰＲｂｆｒＴｅｅｔｂｉｍｎｏｅｂｔｒｅｅｔｉｔａｄｓｂｌｙＩＳ－Ｃｓａｄ１× Ｃｕｅ．ｈｓｌｈｅｔｆｈｅｅｒｐａｂｌｙｎｔｉｔＳＲＰＲｆａｓｔｔａｉａｉ
ＪＡｏｇｂＩＮＧｒｎ — ｎ，ＩＮＧＲｎ —ｏ，ＪＡｇｍｉｉ
Ｊｎ，ＣＥｕＨＮ — ｉ，ＬＡＱ－Ｕｕ－ｎｔＵＮｉｕ，ＹＥＨａｅｇａｆｆ
（．ｅｅｒｈＩｓｔｔｏＳｂｒｐｃｌｏｅｔ，ｈｎｓｃｄｍｙｏｏｅｔ，Ｆｙｎ３１０Ｚｅｉｇｈｎ；１ＲｓａｃｔｕｆｕｔｉａＦｒｒＣｉｅｅＡａｅｆｒｓｙｕａｇ１４０，ｈｊｎ，ＣｉａｎｉｅｏｓｙＦｒａ２ａｌｎａＲｓａｈａｄＤｅｅｏｍｎＣｎｅ，ｔｅＦｒｓｙＡｍｉｉｒｔｎ，ｈｎｚｏ４００，Ｈ ’ａ，ｈｎ）．ＰｕｏｉｅｅｒｎｖｌｅｔｅｔｒＳａｏｅｔｄｎｓａｉＺｅｇｈｕ５０３ｅｎｎＣｉａｗｃｐｔｒｔｏ
建的一种新型的微卫星类分子标记技术，已在遗现
１３１红楠基因组ＤＡ提取．．Ｎ
以ＣＡＴＢ法为基

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化代培红;朱瑜;姚正培;李玮璐;马丽;罗淑萍【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)008【摘要】[目的]建立并优化葡萄种质资源稳定的ISSR-PCR体系,为葡萄种质资源研究和种质创新奠定基础.[方法]以新疆22个葡萄种质资源叶片为材料,采用改良CTAB法提取葡萄基因组DNA,并利用单因素法对影响ISSR反应体系中的各个影响因子进行优化.[结果]优化的最佳ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 30ng,dNTPs 0.3 mmol/L,引物0.5 μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,反应体系为25.0μL.[结论]优化了新疆葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系中的各个影响因子,利用该体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可以用于葡萄种质资源遗传多样性分析.【总页数】5页(P1258-1262)【作者】代培红;朱瑜;姚正培;李玮璐;马丽;罗淑萍【作者单位】新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学科学技术学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学科学技术学院乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】S663.1【相关文献】1.石蒜属植物种质资源ISSR-PCR反应体系的建立 [J], 张雷凡;高燕会;朱玉球;刘志高;童再康;黄华宏2.葡萄ISSR－PCR反应体系的建立与正交设计优化 [J], 张娜;李群;高兴旺;赖晓辉;李佳;丁金鹏3.葡萄种质资源SRAP-PCR反应体系的建立及优化 [J], 苑炜;朱瑜;代培红;夏培蓓;罗淑萍4.葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化 [J], 代培红;朱瑜;姚正培;李玮璐;马丽;罗淑萍;5.葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化 [J], 赖呈纯;范丽华;谢鸿根;余亚白;郑铭西;谢福鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选

２ｔｘＬ１０ｘＢｕｆｅｒ，１．４ＬＭ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），１．５ｔｘＬｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），１．５ＩｘＬｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／ＩｘＬ），０．２ｌｘＬｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／Ｌ，１．２ｔｘＬｔｅｍｐｌａｔｅ（３ｏｎｇ／ｔｘＬ），ａｎｄｄｄＨ２Ｏｔｏ２０Ｌａｔｌａｓｔ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｉｓＰＣＲｓｙｓｔｅｍ，１１０
１．５Ｌ引物（１０ｐｍｏｌ／ｔｘＬ），０．２ｔｘＬ酶（５Ｕ／ｐ．Ｌ），１．２Ｌ模板（３０ｎｇ／ＩｘＬ），ｄｄＨＯ补足体积。并以此体系对１１０条引物进行筛选，最终获得了多态性高，重复性好的引物１２条。
Ｈｙａｃｉｎｔｈ
ＨｕＦｅｎｇｒｏｎｇ。 ’ ＷａｎｇＦｅｉＷａｎｇＺｈｉｑｉａｎｇＲｅｎＣｕｉＢａｏＲｅｎｌｅｉ
１ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００８３；２ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｙｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｍｉｎｇ，２１００３７

观赏桃ISSR_PCR反应体系的优化

研究报告生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N2009年第12期观赏桃ISS R PCR 反应体系的优化林玲汤浩茹刘燕候艳霞(四川农业大学园艺学院,雅安625014)摘要: 采用改良CTA B 法从观赏桃满天红叶片中提取基因组DNA,通过单因素实验探讨了模板DNA 、M g 2+、dNTP s 和T aq DNA 酶等条件对观赏桃ISS R PCR 扩增结果的影响,建立了ISSR PCR 扩增的最佳体系:25 l 反应体系中包含10 Buffe r 2 5 ,l 模板DNA 40ng ,M g 2+浓度2 5mm o l/L,引物浓度0 4 mo l/L,dNTP s 浓度0 4mm o l/L,T aq DNA 酶0 5U 。

利用所建立的体系对红叶桃、菊花桃和春艳等13份材料进行检验,其结果表明优化后的体系适合观赏桃的ISSR PCR 反应。

关键词: 观赏桃DNA 提取ISSR体系优化Opti m izati on for ISSR PCR Reaction Conditions ofOrna m ental PeachL i n L i ngT ang H aor uL iu Y anHou Y anxia(H or tic ult uralCo lle ge ,S ic huan Agric ultural Universit y,Ya !an 625014)Abstrac:t T he i m proved m ethod CTAB w as used to extrac t DNA from leaves of ornam enta l peach m anti anhong .The research discussed different co m ponen ts effect to the DNA a m plifi cation ,i nc l udi ng prog ram te m plate ,pri m er ,d NTP s ,Taq poly m erase and M g 2+,through l adder exper i m ents .T he reac ti on cond iti ons we re opti m i zed and then the opti m a l PCR system for ISS R analysis was establi shed as fo ll ows ,tota l vo l um e 25 ,l 2 5 l 10Bu ffer ,40ng te m plate DNA,2 5mm o l/L M g 2+,0 4mo l/L Pr i m er ,0 4mm o l/L d NTP s ,and 0 5U Taq DNA po l yme rase .The opti m al PCR syste m was tested by 13sa m ples ,show i ng tha t it pe rf o r m ed satisfacto ril y on ornamenta l peach .K ey words : O rnam enta l peach DNA extraction ISSRO pti m a l PCR system收稿日期:2009 09 07基金项目:国家大学生创新性实验资助项目(081062613)作者简介:林玲(1986 ),女,在读硕士研究生,主要从事园艺植物种质资源与生物技术的研究;E ma i :l hdnea @yahoo .co 通讯作者:汤浩茹,男,教授,博士生导师;E m ai:l h t ang @s icau 观赏桃(P runus persica Batsh)是原产我国的古老观赏植物之一,其花、叶、果都有很高的观赏价值[1]。

SSR分子标记中PCR体系的优化研究

SSR分子标记中PCR体系的优化研究摘要：要想获得好的PCR扩增效果，PCR体系中各组分用量必须合理。

本实验以小麦的DNA为模板，采用L16（45）正交设计研究了Taq酶、缓冲液、DNA模板、dNTP和引物五个因素对PCR结果的影响，获得一个稳定可靠的PCR 扩增体系：25μL体系中含1U Taq酶、1.2 mmol·L-1 Mg2+的缓冲液、100ng的DNA模板、0.15 mmol·L-1 dNTP和0.32μmol·L-1的引物。

Abstract: In order to obtain a good effect on SSR-PCR amplification, a suitable PCR system is needed. An orthogonal design was used to optimize SSR-PCR amplification system using wheat genomic DNA as template. Four levels of five factors (DNA template, Taq DNA polymerase, Mg2+, primer, and dNTP) have been tested in this system. The results demonstrated the reaction efficiency was affected by these factors. Based on the results, a stable, productive and reproducible PCR system has been obtained: 25 μL system containing 1.0 U Taq DNA polymera se, 1.2mmol·L-1 Mg2+, 0.15 mmol·L-1 dNTPs, 0.32 μmol·L-1 SSR primer, 100 ng·μL-1 DNA template.Key words: wheat,orthogonal design,SSR,PCRPCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在疾病的诊断、刑侦、古生物学、基因克隆和分子标记辅助育种等等方面有广泛的应用。

ISSR实验过程中常见问题及解决方法

ISSR实验过程中常见问题及解决方法作者：卢超艾伦强何银生刘海华周武先段媛媛程天周张美德来源：《安徽农业科学》2018年第27期摘要 ISSR（inter simple sequence repeat）分子标记是基于PCR技术发展起来的一种多态性检测技术，具有操作简单、多态性和重复性好等优点，近年来已广泛用于植物遗传多样性、亲缘关系等方面研究。

该研究对ISSR-PCR实验过程中常遇到的一些问题，如条带拖尾、有无、扭曲等问题进行了分析总结，并提出了相应的解决方法供参考。

关键词 ISSR；常见问题；分析；解决方法中图分类号 Q37 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0091-04Troubleshooting Analysis in ISSR ExperimentLU Chao，AI Lunqiang，HE Yinsheng et al（Institute of Chinese Herbal Medicine， Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Provincial Agricultural Science and Technology Innovation Center，Chinese Medicine Branch，Enshi，Hubei 445000）Abstract ISSR （inter simple sequence repeat） marker is a PCRbased technique aiming to detect polymorphism in DNA， which features easytooperate， abundant polymorphism and robust reproducibility. To date， ISSR has been widely used in plant genetic diversity and phylogenetic relation study. In this paper， we summarized some problems frequently occured in ISSR experiment and gave relevant suggestions to solve these problems as reference.Key words Inter simple sequence repeat （ISSR）；Frequently asked question（FAQ）；Analysis；Solution基金项目湖北省农业科学院青年基金项目（2014NKYJJ11）；湖北省技术创新专项（鄂西民族专项）（2016AKB053）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）。

RT-PCR反应体系的优化

增加反应体系的灵敏度：1. 分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

为了防止痕量RNase 的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。

用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。

来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。

当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。

2. 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶：在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。

RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。

蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。

逆转录酶催化RNA转化成cDNA。

不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。

RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。

被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。

杜鹃属ISSR-PCR反应体系优化

輥輲訛
1.3.2 ISSR-PCR 体系优化。以 UBC811 为引物，对“毛
叶杜鹃”叶片基因组 DNA 进行 PCR 扩增。对影响 PCR
反应的 Taq DNA 聚合酶、Mg2+、引物、模板 DNA 浓度进
行正交试验设计 L9（34）（表 1），按表 1 编号加样后，每
管加入 2.0μL 的 10×PCR buffer，用灭菌后的 ddH2O 补足 20μL。每个处理重复 1 次。
图 2 单因素调整试验 PCR 产物电泳图注：1~9 为表 2 的处理组合编号。MDL2000。CK 为对照。
2.2 ISSR-PCR 反应体系稳定性检测
根据体系优化试验结果，用引物 UBC 810 对 5 个
杜鹃种进行 PCR 扩增，电泳结果显示（图 3）：扩增谱
带清晰，背景弥散轻，多样
性丰富，表明所建立的杜
ISSR 分析[J].北方园艺,2018（, 24）:79-84.
[11]李国帅,曹福祥,彭继庆,等.野生小果油茶 ISSR-PCR 反应体系的
建立与优化[J].中南林业科技大学学报,2014,34（4）:36-43.
[12]王惠君,王文泉,卢诚,等.中药艾总 DNA 的提取及 ISSR-PCR 反
参照潘丽梅等[6,8-10]的设定扩增程序为：94℃预变
性 4min；94℃变性 45s，退火 1min，72℃延伸 2min，40
个循环；72℃延伸 8min，4℃保存。
采用 2%琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，用
紫外与可见分析装置观察并拍照记录。根据电泳的正
交试验结果，对各处理进行综合评定。
[15]赵丽华,李名扬,王先磊,等.石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系
的 ISSR 分析[J].果树学报,2011（1）:66-71.

珙桐愈伤组织ISSR—PCR体系的建立

此前，在梨【ｌ０１、四大怀药ｌ、霍山石斛ｌｌ２］、马铃薯【
ｕ１
、
月季１１、安祖花【Ｉ５】等多种植物中，长期继代的愈
伤组织已经被用来诱导分化，并取得了成功。但
是，随着继代次数的增加，愈伤组织往往会发生不
同程度的遗传变异ｔ］，有的表现为染色体的变异，
有的表现为分化能力的变化ｌｌ７１。本研究以珙桐愈
引物参照加拿大哥伦比亚大学提供的ＩＳＳＲ
引物序ｆｆａＪ（ＵＢＣ８０１一ＵＢＣ９００），由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。ＴａｑＮＤＡ聚合酶、ＰＣＲ
珙桐愈伤组织ＩＳＳＲ — ＰＣＲ体系的建立
荣熔陈蕤坤田金华魏佳佳张静徐莺
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘要：采用改良的ＣＴＡＢ法提取珙桐愈伤组织ＤＮＡ，通过单因素试验分析了退火温度、循环次数、模板用量、ｄＮＴＰ浓度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、引物浓度对珙桐愈伤组织ＩＳＳＲ— ＰＣＲ扩增结果的影响。结果表明，适宜的珙桐愈伤组织ＩＳＳＲ— ＰＣＲ扩增条件是：２５ｌＰＣＲ反应体积中，２０ｎｇ模板ＤＮＡ，０．４ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，１．ＯＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，０．８ｍｏｌ／Ｌ引物。最佳的扩增程序为：预变性９４℃ ５ｍｉｎ；变性９４℃ ４５ｓ，退火５５．１ｏＣ４５Ｓ，延伸

红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立

红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立
红花石蒜 ISSR-PCR反应体系的建立
以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的'影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2+、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.
作者：杨志玲冯刚利谭梓峰栾启福王承南YANG Zhi-ling FENG Gang-li TAN Zi-feng LUAN Qi-fu WANG Cheng-nan 作者单位：杨志玲,谭梓峰,栾启福,YANG Zhi-ling,TAN Zi-feng,LUAN Qi-fu(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳,311400) 冯刚利,FENG Gang-li(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳,311400;中南林学院资源与环境学院,湖南长沙,410004) 王承南,WANG Cheng-nan(中南林学院资源与环境学院,湖南长沙,410004)
刊名：林业科学研究ISTIC PKU 英文刊名：FOREST RESEARCH 年，卷(期)： 2006 19(4) 分类号： S567.2 关键词：红花石蒜叶片 ISSR-PCR。

送春与多花兰杂种ISSR-PCR反应体系的建立与优化

送春与多花兰杂种ISSR -PCR 反应体系的建立与优化周丽1,2,胡春根1*(1.华中农业大学园林学院,湖北武汉430070;2.黔西南民族师专化生系,贵州兴义562400)摘要 [目的]建立与优化送春与多花兰杂种IS SR -P CR 的反应体系。

[方法]用C T AB 法提取送春、多花兰和送春×多花兰杂种的基因组D N A,针对IS SR -PC R 扩增的体系中的T aq 酶浓度、M g 2+浓度、dN T P 浓度和引物的用量4个因素,进行L 9(43)正交试验,用引物U BC 827扩增两亲本的混合D N A,所得P CR 产物在琼脂糖凝胶上检测,同时针对去离子甲酰胺对反应的影响进行初步对照试验。

[结果]根据P CR 产物的琼脂糖凝胶检测结果,由试验得到的最佳反应体系为:1×bu ffer 、2.5m m o l/L M g 2+、0.6μm o l/L 引物、0.25m m o l /L dN T P 、1U T aq 酶、0.4μl 去离子甲酰胺、50n g 模板DN A,总体积为20μl 。

[结论]该反应体系的建立为利用ISSR 技术进行兰花遗传连锁图谱构建、基因定位、种质资源鉴定与分类等提供参考。

关键词 IS SR;反应体系;正交设计中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)17-07904-03E s tab lishm e n t a n d O p ti m iza t ion o f ISSR -PCR R e a c t ion Sy s temfo r th e H y br id o f C y m bid iu m cyperifo li m v a r .s ze c h ua n icuman d C.floribun-du mZHOU L i e t a l (C o llege o f H or ticu ltu re an d F ore stry S c ien ce ,H u a zh on g A g r icu ltu ra l U n ive rs ity ,W uh an,H u be i 430070)A b s tra c t [O b jective]T h e a i m o f th e stu dy w a s to e stab lish an d op ti m ize IS SR -P CR reaction sy stemfo r h ybr id o f C y m b id iu m cyp erifo li m va r.szech u an icuman d C.flo ribundu m.[M e th od]T h e m e th od o f C T AB w a s app lied to ex tract th e gen om e D N A o f C.cy perifo li m , C.flo ribundu m an d th e irh ybr ids .A L 9(43)o r th ogon a l te st w a s de sign ed to s tudyth e e ffe ct o f T aq po lym e ra se ,M g 2+,dN T P an d p ri m e r w ith d ifferen t le ve ls inIS SR -P CRreaction sys tem.T h e m ix tu re o f tw o pa ren ts gen om e D N A w a s am p lified by u sin g p ri m e r U BC 827,an d th e P CR p rodu cts w e re exam i n ed on ag a ro se ge l .T h e i m pact o f de ion ized fo rm am ide on ISSR -P CRreac tion w a s ev a lu a ted th rou ghth e pr i m a ry con tro l tes t .[R e su lt]B ased onth e re su lt o f PC R p rodu cts tested on th eag aro se g e l ,an opti m umreac tion sy stemobta i n ed in th e te st w a s a s fo llow s :1×bu ffe r ,2.5m m o l/L M g 2+,0.6μm o l/L p ri m e r ,0.25m m o l/L dN T P,1U T aq po lym e ra se ,0.4μl de ion ized fo rm am ide ,50n g D N Atem pla te ,to ta l vo lum e o f rea ction sys te mbe in g 20μl .[C on clu sion ]T h e e stablishm en t o f IS SR -P CRreaction sys temprov ide s th e re feren ce fo r o rch id gen e tic link a ge m app i n g ,g en e m app in g ,ge rm p la smi den tifica tion an d cla ssifica tion e tc .by u s-in g IS SR tech n iqu e.K e y w o rd s In te r s i m p le sequ en ce repea t ;R e action sys te m;O r th o gon a l design作者简介周丽(1978-),女,贵州兴义人,硕士,讲师,从事名贵观赏植物、药材及兰科植物的快速繁殖研究。

獐ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选

獐ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选
獐ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选
利用正交试验L16(45)对影响獐(Hydropotes inermis)ISSR-PCR 反应的Taq DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度及模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行优化,同时对退火温度进行梯度PCR反应,以建立适合于獐ISSR-PCR反应的最佳体系.最终确定獐25μL ISSR-PCR反应体系为:Taq酶1.25 U·25μL-1、Mg2+浓度2.5 mmol·L-1、引物浓度0.3 μmol·L-1、DNA模板量350 ng·25μL-1、dNTP浓度0.15 mmol·L-1.在此基础上,利用优化的反应体系成功筛选出10条用于獐相关研究的ISSR引物并确定了各自的最佳退火温度,为今后利用ISSR技术进行獐的物种鉴定与分类、亲缘关系、系统发育和生理病理学研究奠定了技术基础,也为开展其它大型资源动物如黑麂的保护遗传学研究提供理论基础.
作者：张龙龙鲍毅新于华会许婧孙波 ZHANG Long-long BAO Yi-xin YU Hua-hui XU Jing SUN Bo 作者单位：张龙龙,鲍毅新,许婧,孙波,ZHANG Long-long,BAO Yi-xin,XU Jing,SUN Bo(浙江师范大学生态研究所,金华,321004)
于华会,YU Hua-hui(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江,富阳,311400)
刊名：生态科学英文刊名：ECOLOGICAL SCIENCE 年，卷(期)：2009 28(4) 分类号：Q953 Q959.842 关键词：獐正交试验 ISSR 引物筛选。

PCR优化策略

PCR优化策略特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。

PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。

PCR的有效性是指经过相对较少的 PCR循环能获得更多的产物。

而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。

理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。

研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。

因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。

这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。

其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。

1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。

理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。

实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。

为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。

需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。

例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和 1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。

2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化李建辉;冯永辉;姚永斌【期刊名称】《杭州师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(006)004【摘要】利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2-浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris·HCl,pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.【总页数】4页(P288-291)【作者】李建辉;冯永辉;姚永斌【作者单位】杭州师范大学,生命与环境科学学院,浙江,杭州,310036;台州学院,生态研究所,浙江,临海,317000;大战中学,浙江,仙居,317321;横溪中学,浙江,仙居,317312【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究 [J], 汤永磊;周超;祁鹏志;吴常文;郭宝英2.正交设计优化广西火桐ISSR-PCR反应体系 [J], 代文娟;骆文华;马虎生;符支宏;唐文秀;赵博;盘波;黄仕训3.桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化 [J], 刘玲; 唐仕成; 郑丹; 柯皓天; 吕银4.黑老虎ISSR-PCR反应体系的建立与优化 [J], 唐健民;漆小雪;蒋运生;熊忠臣;邹蓉5.龙头鱼ISSR-PCR反应体系的建立与优化 [J], 褚梦洁;王铮;林彦均;朱兰倩;胡静雯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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Ｎａｎｎ３０２ｈｎ；．ｕｎｘｉｕＳａｅＦｒｔａ，ａｉ，Ｇａｇｉ４１０ｎｉ５００，Ｃｉ２ＧａｇｉｄｔｏｅｒＬｉｎｕｎｘ５６０，ＣｉａｇａＷｅｔｓＦｍｂｈ）ｎ
２ＬＰＲ反应体积中，ｂｆｒ（０ｍＴｉＨＩＨ．，５５Ｃｕｅ１Ｍｒ－Ｃ，ｐ９００ｍＭ１．％ＴｉｎＸ１０，１２ＴｑＤＡｓＫＣ，０１ｒｏ－０）．５ＵａＮｔ聚合酶，４ｄＴｓＯ２ｍＭ，０４Ｍ引物，２０ＭＣ２０ｎ板ＤＡ。种ＮＰ各．．．ｒＭｇ１，５ｇ模ａＮ关键词：红锥；ＩＳＳＲ；优化；遗传多样性
ＦｒｔｙＭｉｉｔｙｏｉａｏｅｒｎｓｒｆＣｈｎ，ＧｕｎｘｙＬｂｒｔｒｆＳｐｒｒＴｉｅｅｓＲｅｏｒｅＣｌｖｔｎ，ｓａｇｉＫｅａｏａｏｙｏｕｅｉｍｂｒＴｒｅｓｕｃｕｔａｉｏｉｏ
ｐｉｒ，２．ｒｍｅｓ０ｍＭ／ｇ２ａｄ５ｇｔｍｐａｅＤＮＡｏａ２ＬｒａｔｎｖｌｍｅＬＭＣ１ｎＯｎｅｌｔｉｔｔｌ５ｎｅｃｉｏｕ．ｏＫｅｒｓａｔｎｐｉｈｓｒｘ；ＩＳ；ｏｔｚｔｎ；ｇｎｔｉｅｓｔｙｗｏｄ：ＣｓｏｓｓｙｔｉａＳＲｐｉａｉｍｉｏｅｅｉｄｖｒｉｙｃ
ＳＲ—ＰＲｏａｔｎｐｉｈｓｉａｌｗＣｆＣｓｏｓｙｔｘｗｓｓｆｌｓ：１ａｕｆｒ（０ｍＭ／ＬＴｒ — ｌｐ９０５ａｓｒａｏｏ ×Ｔｑｂｆｅ１ｉＨＣ，Ｈ．，Ｏｓ
ｍＭ／Ｃｎ．ＬＫ１ｄ０１％Ｔｒｏ一０），．５ＵａＮＡｐｌｍｅａｅ，．ａｉｎＸ１０１２ＴｑＤｏｙｒｓ０２ｍＭｔ４×ｄＰ，０４ＮＴ．Ｍ
中图分类号：￥９．７文献标识码：Ａ７２１
ＴｈｔｍｉａｉｎｏＳＲ－ＣＲａｔｏｙｔｍｏｓａｏｓｓｈｓｒｘｅＯｐｉｚｔｏｆＩＳＰＲｅｃｉｎＳｓｅｆｒＣａｔｎｐｉｙｔｉ
ＬＵｉｏｇ，ＤＧｎｌ，ＹＩＨａｌ１ＯＮＭｉ— ＡＮＧＫａｔｉ，ＪＡ —ｎｉｉａ。ＩＮＧＨｕ２ａ，ＱＩＺ．ａＮｉｌｈ（．ｕｎｘＦｒｓｙＲｅｒｈＩｔｕｅ１Ｇａｇｉｏｅｔｅａｃｎｉｔ，ＫｅａｏａｏｙｏｅｔｌｏｔａｔｒｗｎｉｅｕｉａｏｆｒｓｓｔｙＬｂｒｔｒｆｎｒｕｈＦｓｇｏｉｇＴｍｂｒｌｖｔｎｏＣａＳ — Ｃｔｉ
第４０卷
第４期
广
西
林
业
科
学
Ｖｏ．０ＮＯ４１４．
Ｄｅ．ｃ２０１１
２１０１年１２月
ＧｕｎｘｒｓｒｃｎｅａｇｉＦｏｅｔｙＳｉｃｅ
文章编号：１０ —１２ —２１（）一０８一Ｏ０６１６０１４２８４
ｔｒ，ｔｍｐａｅＤＮＡｏａｅｕｅｅｌｔｄｓｇ，ＭｇｃｎｅｔａｉｎＮＴＰｏｃｎｒｔｎａｄｕｉｏｑＤＮＡｏｙｏｃｎｒｔ，ｄｏｓｃｎｅｔａｉｎｎｔｆＴａｏｐｌ— ｍｅａｅｗｅｅｓｌｃｅｎｐｉｚｄ．ＴｈｅｕｔｈｗｅｈｔｈｅｃｉｎｓｓｅｂｉｇｓｉｂｅｆｒＩ — ｒｓｒｅｅｔｄａｄｏｔｍｉｅｅｒｓｌｓｏｄｔａｅｒａｔｙｔｍｅｎｕｔｌＳｓｔｏａｏ
红锥ＩＳ — ＣＳＲＰＲ扩增体系的优化
刘海龙，董民利２，杨开太，蒋华２，覃子海
（．１广西林业科学研究院国家林业局中南速生材繁育实验室
广西优良用材林资源培育重点实验室，南宁
摘
５００；２广西国有维都林场，来宾３０２．
５６０）４１０
要：对广西红锥种群的ＤＮＡ进行提取和ＩＳ —ＣＳＲＰＲ扩增体系进行优化。分析了退火温度、模板ＤＡ浓度、Ｎ
Ｍｄ浓度、ｄ Biblioteka ｓＮＰ浓度、ａＤＡ聚合酶用量对反应结果的影响。红锥ＩＳ —ＣＴｑＮＳＲＰＲ分析较适宜的扩增体系是：
ＡｂｔａｔＴｈｅＤＮＡｎＳｓｒｃ：ａｄＩＳＲ．ＰＣＲｍｐｉｉａｉｎｏａｇｉａｌｆｃｔｆＧｕｎｘＣａａｍｏｉｙｔｉｏｔｐｓｓｈｓｒｘｗａｘｔａｔｄａｓｅｒｃｅｎｄ
ｏｔｚｄｒｓｅｔｅｙｐｉｅｅｐｃｉｌ．ＴｈａｔｒｉｈａｆｃｅｈＳＲｍｐｉｃｔｎｓｃｓａｎａｉｇｔｍｐｒ・ｍｉｖｅｆｃｏｓｗｈｃｆｔｄｔｅＩＳａｌｉａｉｕｈａｎｅｌｅｅａｅｆｏｎ