山药多糖的结构鉴定
山药及不同炮制品多糖含量分析
实验研究山药及不同炮制品多糖含量分析杨武德,李白玲,冯 靖(贵阳中医学院药学系,贵州贵阳 550002)内容提要:目的:考查山药炮制与其有效成分多糖含量的关系。
方法:紫外分光光度法。
结果:山药及不同炮制品中多糖含量按以下顺序减少;生品,蜜麸炒山药,炒山药,米炒山药,土炒山药,焦山药,炭山药,麸炒山药。
测定结果:经统计检验说明各炮制品中多糖含量均较生品有显著降低(p<0101或p<01001)。
关键词:山药;炮制;多糖;含量测定中图分类号:R28515 文献标识码:B 文章编号:1002-1108(2004)03-0061-01 山药又称薯蓣,始载于《神农本草经》,列为上品,来源于薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposiita Thunb的干燥根茎,具有补脾,补肺,固肾,益精的功效,主治脾虚泄泻,久痢,虚痨咳嗽,消渴,遗精带下,小便频数等症。
据临床药理研究,山药根茎含薯蓣皂甙,淀粉,胆碱多糖等[1]。
山药多糖有调节或增强免疫功能,降血糖,抗肿瘤等功效[2]。
山药为一种常用中药,其炮制方法较多,据文献记载有生品,蜜麸炒,炒黄,米炒,土炒,炒焦,炒炭,麸炒等[3]。
1 仪器、试剂和药材111 仪器 DU-70紫外分光光度计(美国贝壳曼)。
112 试剂 所用试剂均为分析纯。
113 对照品 葡萄糖(北京化工厂,AR级)。
114 药材 山药采自贵州省清镇市大水库,经本院中药鉴定研究室刘梵教授鉴定为薯蓣科植物野生(Dioscorea opposiitaThunb)的根茎。
本实验用其根茎。
115 炮制品的制备生品:将山药抢水洗后,切成厚片,60℃烘干。
炒黄:取净山药片50g置热锅内,中火炒至表面焦黄色,取出晾凉,得率8116%炒炭:取净山药片50g,用武火炒至表面焦褐色,断面焦褐色,得率7810%土炒:取黄土适量于热锅中,炒至灵活态,加入净山药片50g,均匀翻炒,得山药片由软向硬转化时取出过筛去土,摊开放凉。
中药山药中多糖成分提取、分离、含量测定及对胃肠功能的影响
中药山药中多糖成分提取、分离、含量测定及对胃肠功能的影响姓名：汪岩学号：S2010210 专业：中药学山药为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎。
山药生用功偏补肾生精，益肺肾之阴，麸炒则长于益脾和胃，益肾固精[1]。
临床上麸炒山药主要做为滋阴或补阳的臣药，功偏补益[2]。
补益药的药理研究主要包括免疫学研究[3]，山药多糖具免疫调节作用[4]，对对胃肠的功能具有一定的影响。
本实验研究以大黄造脾虚模型小鼠，研究山药多糖成分对胃排空率及肠推进率的影响，同时以胸腺指数和脾脏指数作为衡量模型动物体内免疫水平的基本指标，考察山药麸炒前后多糖成分补脾健胃作用及相关免疫指标的变化，为进一步阐明山药补脾健胃作用的可能机制。
1 仪器、材料与山药多糖的提取1.1仪器与试药分析天平；蒸发仪；离心机；紫外分光光度计。
大黄（注明购买地点、批号）；阿托品（注明厂家、生产批号）；生理盐水（注明生产厂家、批号）；酚红（厂家、批号）；淀粉酶（厂家、批号）；墨汁；NaOH；其它试剂为分析纯。
1.2动物有生产许可证和使用许可证的小鼠80只，其中雌雄各半，体重比较均衡。
1.3山药多糖的提取取山药药材500g，加水冷浸12h，水煎煮1.5h，两次，合并水煎液，加入2%新鲜配制的淀粉酶溶液于60℃保温5min，目的是出去淀粉。
再进行抽滤，滤液浓缩至体积为500ml，以95%乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜，抽滤，滤渣依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，50℃真空干燥既得山药多糖（粗多糖）。
1.4大黄水煎液的制备取大黄饮片50℃热风干燥，然后称取500g，加入8倍量水冷浸12h后，水煎煮1.5h，两次，合并滤液，最后将滤液浓缩至浓度为1g生药材/ml，储存备用。
2精制山药多糖的分离将山药粗粉50 g ，置索氏提取器中，经石油醚( 60～90℃) 回流提取，弃提取液，药渣挥干石油醚，再用80％乙醇回流提取，以除尽单糖，低聚糖及醇溶性杂质，药渣挥干溶剂后，加500 ml水于90℃，提取，合并提取液。
☆山药多糖研究进展
凝胶柱层析、高效液相层析、微晶纤维素柱层析、 ＤＥＡＥ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析和透析法等方法纯 化山药多糖，然后利用层析法鉴定纯度，ＨＰＬＣ测 定分子质量，ＧＣ－ＭＳ测定单糖摩尔比，ＩＲ和ＮＭＲ 分析其结构。何书英等口７３纯化得山药多糖ＲＰ，相 对分子质量８１ ０００，摩尔比１：１．２４：６．４２（岩藻 糖：丙三醇：赤藓醇），主要由带有分枝的１—４连接 的吡喃糖苷骨架构成，同时含有少量１—３键型的 岩藻糖。Ｚｈａｏ等［１８］纯化得白色粉末状山药多糖 ＲＤＰＳ－Ｉ，相对分子质量４２ ０００，比旋光度＋１８８．４。
（ｃＯ．８０，Ｈ２
和７ ３００。从各学者的研究发现山药多糖的种类较
多，分子质量差异大，单糖组成多样，糖苷键连接方 式多。这是由于山药的品种繁多，山药生长环境不 同，产生的山药多糖也多种多样，不同结构组成的 功能活性及其作用机理将成为未来探讨的方向。 ３
生理活性
３．１促进肠胃功能
Ｏ），特性粘度［．，１］一１６．４８
ＷＡＮＧ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ
Ｈｏｎｇ—ｘｉｎ，
ＷＡＮＧ Ｙｕａｎ－ｈｕｉ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｙａｍ（Ｒｈｉｚｏｍａ Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＲＤＰ）ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ
１．３微波辅助法 微波辅助是在水浸提的同时加入微波，利用不 同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使 物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选 择性加热，从而使被提取物从物质或体系中分离， 该法溶剂用量少，提取率高，提取速度快［９］。许本 波等采用正交试验优化微波辅助提取山药多糖工 艺，粗多糖得率１０．５２％，最佳工艺：功率为４６４ Ｗ、 料水比１
淮山药多糖的研究
< 为样品 ( ( 式中 8 为样品溶液的葡萄糖的质量，
〔 J〕 溶液的稀释倍数， Y 为换算因子， X 为样品的质量
"# $ ( 粗多糖的纯化分离 "# $# ! ( 反复热溶： 将粗多糖 D<$ 用少量蒸馏水在 热水浴中搅拌溶解， 超声 &) MN-， 离心 （ ’))) （ Q)I ） K L MN-， @ MN-） ， 残渣继续用少量蒸馏水热溶超声， 合 并两次离心后的上清液。
〔 0〕
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数据相符，
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山药中多糖的含量测定方法学研究
山药中多糖的含量测定方法学研究徐广忠;刘亚豪;周军;丁志远【摘要】目的:建立山药中多糖含量的测定方法,测定并比较不同产地山药中多糖的含量.方法:采用紫外-可见分光光度法测定山药中多糖的含量,苯酚-硫酸法显色,显色条件:苯酚浓度:5%;苯酚用量:1mL;硫酸用量:7mL;温度:40℃;时间:15min;测定波长:490nm.结果:葡萄糖浓度在10.07~100.7μg/ml范围内呈良好线性关系,r=0.9995,重复性RSD=1.1%(n=6),平均回收率98.5%,RSD=1.2%(n=6).结论:本法简便、准确、重复性好,适用于山药中多糖的含量测定,且测得不同产地的山药中多糖的含量存在较大差异.【期刊名称】《黑龙江科技信息》【年(卷),期】2017(000)034【总页数】3页(P3-5)【关键词】山药;多糖;紫外-可见分光光度法【作者】徐广忠;刘亚豪;周军;丁志远【作者单位】亳州职业技术学院,安徽亳州 236800;安徽亳州浙皖中药饮片股份有限公司,安徽亳州 236800;安徽亳州浙皖中药饮片股份有限公司,安徽亳州 236800;安徽亳州浙皖中药饮片股份有限公司,安徽亳州 236800;安徽广美药业股份有限公司,安徽亳州 236800【正文语种】中文山药为薯蓣科植物薯蓣的干燥根茎,广泛分布于我国大部分地区,具有很高的营养价值和药用价值,是常用的药食两用植物。
食用山药主要分布在南方地区,而药用山药主要分布在北方地区,尤以怀山药为代表,其药用价值较高 [1]。
山药性甘,平,归脾、肺、肾经。
具有补脾养胃,生津益肺,补肾涩精的功效,用于脾虚食少,久泻不止,肺虚喘咳,肾虚遗精,带下,尿频,虚热消渴等[2]。
山药中含有多糖、尿囊素、糖蛋白、皂苷、蛋白质、氨基酸、淀粉和脂肪等多种成分,其中多糖是山药的主要活性成分,具有降低血糖、调节免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种药理作用[3-5]。
然而药典及各地方药品标准中,尚未将山药中多糖含量作为质量控制项目。
山药多糖的提取分离和结构测定
乔善义&! ，王立岩! ，赵毅民& ，张永祥& ，姚新生!
& 军事医学科学院毒物药物研究所， 北京 ! 沈阳药科大学天然药化教研室， 沈阳 &&""&1 &"",%"；
【摘
要】 目的： 提取分离并测定山药多糖的结构。方法： 依次用水提取， 乙醇和十六烷基三甲基溴胺盐
沉淀法得到粗多糖； 用葡聚糖凝胶柱层析和高效液相层析纯化多糖并测定分子量； 甲基化分析和薄层层析分析 多糖酸水解产物， 结合 @A 和&# B’CA 确定单糖组成、 连接方式和端基碳构型。结果： 从山药中得到两个均一多 糖 D& 和 D! 。结论： 它们均为 ［ （&"-） D& 和 D! 的分子量分别为 1# """ 和 + -"" E70， $ !$F09 $］ ? 型葡聚糖。 ! 【关键词】 山药； 多糖； 结构鉴定 【中图分类号】 G%#*， A!,- ) ! 【文献标识码】 3 【文章编号】 &1+!$#1%& （!""#） "#$"&%%$"#
糖的作用特点和结构， 探讨多糖的构效关系， 我们 对山药多糖进行了研究。从山药中分离得到两个 中性多糖 D& 和 D! ， 并应用化学和光谱方法， 对其结 构进行了鉴定。 ! &J& 材料和方法 药 材
燥得到中性多糖部分， 记为 D\O； B.3K 沉淀 用 离心除去不溶物， 适当浓缩后用 6(0 Z Q ’7B0 溶解， 沉淀经冷冻干燥得到酸性多糖部 *%[ 乙醇沉淀， 位， 记为 OO.。 D\O 和 OO. 经紫外检测 !," ?6 无 吸收， 说 明 基 本 无 蛋 白 类 成 分。 D\O 经 D/LH7M/N （洗 脱 剂 为 水， 流 速 为 !" 60 Z %" F$&"" 凝 胶 层 析 ， 苯酚$硫酸法检测， 合并主要吸收峰馏分， 冷 68?） 冻干燥得纯化多糖 D& 和 D! 。凝胶层析图见图 &。 &J纯度检查和分子量测定 采用 SOQB 法检查所得多糖的纯度和测定分 子量。柱为 OH/?(6/?/N 的 K8(>/L D5B$D#""" （#"" X ， 流动相为 "J! 6(0 Z Q ’7B0， 流速为 & 60 Z +J, 66） 根据峰形判断样品纯度。由标准 E/NP:7? （分 68?， 子 量 分 别 为 %+ !""， -# """， !& -""， &+ %""， % """ 的分子量对数与保留时间求得标准曲线， 求出 E70） 回归方程为 0Y + ] +J-" ^ "J#" （ 。 * & ] ^ "J**%" ）
山药多糖的分离纯化及其结构鉴定
以及ＧＣ－ ＭＳ分析测定该中性糖为葡萄糖和甘露糖组成， 其摩尔比为０．５６∶０．４４。红外光谱和ＮＭＲ谱分析
显示该中性糖有α－ 异构体吡喃己糖环， 它们归属为α－ Ｄ－ 葡萄糖和α－ Ｄ－ 甘露糖。
关键词： 山药； 多糖； 纯化； 结构
中图分类号： ＴＳ２０１
文献标识码： Ａ
文章编号： １００５－ ９９８９（２００７）０５－ ０１０９－ ０４
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
分离纯化获得山药水溶性多糖的理化性质测定 显示： 硫酸－ 苯酚反应和硫酸－ 蒽酮反应呈阳性， 考 马斯亮蓝反应呈阴性， 这与山药水溶性多糖的紫外 扫描图所反应的在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处未见核酸和蛋白 质的特征峰的结果一致（见图３）。菲林试剂反应呈阴 性， 碘－ 碘化钾反应呈阴性， 说明山药水溶性多糖中 不含淀粉。分离纯化获得山药水溶性多糖的比旋光 度［α］Ｄ为＋１６２．５°。分离纯化获得样品的理化性质测定 结果显示， 样品纯度高， 属于水溶性中性多糖。
树莓多糖的提取率在３．４４％到５．７０％之间波动。
４ 结论
本试验采用热水浸提法提取树莓多糖的最佳工 艺为温度１００℃、提取时间６０ｍｉｎ、物液比为１∶１０， 分 析表明温度因素是影响多糖提取率的主要因素， 此
条件下树莓多糖的提取率在３．４４％￣５．７０％波动。
参考文献： ［１］ 田庚元．天 然 多 糖 的 研 究 与 应 用［Ｊ］．中 草 药，２０００，（１０）：４０－
由图１可以看出， 在不添加离子强度的洗脱条件 下山药水溶性多糖在ＤＥＡＥ－ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ５２上只有一个 峰， 而且收集该峰的糖液浓缩， 经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ １００ （见图２）追踪检测， 仍然为一个峰， 这说明山药水溶 性多糖在经过ＤＥＡＥ－ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２柱即可完全分离。
山药多糖研究概述
阚建全等研 究发 现， 山药活性 多糖对３ 种致突 变物及黄 曲霉毒 素的致突变
性均有 显著 的抑制 作用 。 明山药活性 多糖具 有抗突变 活性Байду номын сангаас 表 其作用机 制主要 是通 过抑 制突变物 对菌株 的致 突变 作用而 实现 的。 ２ ５ 山药多糖 的肝损 伤保护作 用 孙 设宗等探 讨 山药多糖对 小 鼠Ｃ Ｌ 肝 损伤 的保护作 用及可 能作用机制 ， Ｃ４ 发现 山药 多糖可减 轻实 验性肝损 伤所致 炎性 反应 ， 降低肝体 指数， 降低血清 中 Ａ Ｔ Ｓ 活性和 Ｍ Ａ Ｌ 、Ａ Ｔ Ｄ 的含量 ： 提高肝 细胞 中Ｇ Ｈ的含 量及 降低 ＭＡ的含 量 。 Ｓ Ｄ 表
０ ３ ： ｌ 。再利用蒽 酮 Ｂ １ ７ ０ １ １ 硫酸 比色 ，以葡萄糖 作为对 照进行 凝胶色谱 分析 ， 测 定 Ｒ Ｐ ２ 的相对 分子质 量为 ４ ２ ０ ＤＳ Ｉ ２０。 顾林 等对水 溶中性 多糖的水解 产物进 行薄层 层析 ，初步 认为 山药水溶 性
自由基 的作用 ，对 实验性 肝损伤 有保护 作用 ，镁 离子 、山药多糖 联合应用 有
１山药 多糖化学 性质
１ １ 山药多糖 的分离纯 化 ． 乔 善义等依 次用 水提取， 乙醇和 十六烷 基三 甲基溴 胺盐沉 淀 法得到 粗多 糖 ，再利 用葡聚糖 凝胶 柱层析 和高 效液相层 析纯化 到酸 性多糖 部位 Ｐ Ｔ Ｐ 。进
一
多抗 肿瘤 活性 ，发 现 ５ ｍ ｋ 对 Ｌ ｗ Ｓ 癌有显 著地抑 制作用 ， ０ ｇ・ ｇ １ ｅｉ肺 而对 Ｂ ６ １
黑色 素瘤没有 明显 作用， 等于或 高于 １０ｍ ｋ一 的 ＲＰ — 对 Ｂ ６ ５ ｇ・ ｇ １ Ｄ Ｓ Ｉ １ 黑色素瘤 和 Ｌｗ Ｓ ｅ ｉ 肺癌都 有显著 的抑制 效果， 中等剂量 （５ ｇ ｋ— ） 且 １０ｍ ・ ｇ １作用最 佳。 他 们进一 步将 多糖 化学 改性发现 ， 度羧 甲基化 、 低 低度 甲基化和 中度 乙酰 化均 能 显著地 提高 多糖 的抗 肿瘤活 性，而部 分降解和 硫酸 酯化会使 多糖的抗 肿瘤活
山药功能性成分多糖的研究进展
2020.6经验交流山药功能％成分多糖的研究进展南怀林王耀琴刘建平王小兵张峰(山西省农业科学院经济作物研究所汾阳032200)摘要：本文作者对近年来山药资源、不同地域、土壤肥效及栽培模式影响山药多糖含量情况及多糖功能性进行了综述，为进一步深入研究山药多糖提供参考#关键词：山药；资源；多糖；不同地域；土壤肥效；栽培模式山药(Dioscorea opposita Thunb)为薯•科(Dioscoreaceae'植物薯•地下块茎，是我国传统的药同源性植物［1］，在河南、河北、山、山东、陕西等地植。
目前，山药成功的和报道叫山药山药中主要功成分，具有冈、免疫调节W-51、抗氧化〔/-7］、抗糖尿病冏、抗突变问生，并无机盐结合后形成骨质，使,以润滑㈣。
本文作者合山药>功的，山药源、不同地域、模式影响山药量功进，旨在为山药多糖的参考。
1山药品种资源徐琴［11］的测定结果表明，苏北产淮山药和铁棍山药多糖含量分别为1.37%和1.20%。
黄梦甜等M测定了三种国家地理标志山药，结果表明，lg河南焦作的“铁棍山药”、湖北利川的“利川山药”和湖北武穴的“佛手山药”的总量别为36.93mg、44.34mg、36.08mg。
袁辉等'13啲测定结果表明，“明豆子”总量高为0.3812%,大白玉含量低为0.1302%,$大合玉”、“鸡皮糙”、“九斤黄”、“西施种子”总量依次降低。
谢彩侠网同品山药品质的研究结果表明，同山药品种根量存在极显著差异，高低依次为铁棍山药〉花籽山药〉白玉山药〉山西太谷山药。
张卫明等问对云南昆明山药铁棍山药的品质进比较，果表明，昆明山药多糖含量(0.87%)明显高于铁棍山药(0.53%)。
李丹等'16)采用蔥酮-硫酸法测定铁棍山药和太谷山药各个生育时期的根状山药的量，果表明，铁棍山药的量均高于太谷山药中的量。
华树妹问采硫酸-苯酚法61份福建山药质源量，用DPS软件进行聚类分析，对山药质资源的量进评价，结果表明，61份福建山药质资源中，多糖含量为0.7288%~8.6377%，平均含量为2.4477%,极差为7.9089。
山药多糖的降糖机制研究
山药多糖的提取工艺
提取方法：采用水提醇沉法提取山药多糖
提取工艺流程：原料→清洗→破碎→热水浸提→过滤→浓缩→乙醇 沉淀→离心分离→洗涤沉淀→干燥→产品
最佳提取工艺条件：浸提温度为90℃，浸提时间为4h，液料比为 20∶1，乙醇沉淀体积分数为80%
注意事项：提取过程中应严格控制温度、时间、液料比和乙醇体积 分数等参数，以保证提取效率和产品质量
山药多糖的分子结构
分子组成：由多个单糖分 子聚合而成
聚合方式：通过糖苷键连 接
分子量：大小不一，取决 于聚合程度
结构特征：具有分支状结 构，较为复杂
山药多糖的理化性质
山药多糖是一 种水溶性膳食 纤维，具有较 高的持水力和
膨胀力
山药多糖的化 学结构由多个 单糖分子通过 糖苷键连接而 成，具有复杂
的分支结构
安全性评价与质量控制的展望
未来发展方向：建立更加完善的安全性评价体系，加强质量控制标准制定 技术创新：利用现代科技手段提高安全性评价与质量控制的准确性和可靠性 国际合作：加强国际间的交流与合作，共同推进安全性评价与质量控制技术的发展 人才培养：加强相关专业人才培养，提高安全性评价与质量控制领域的研究水平
山药多糖可开发成新型降糖药物， 具有广阔的市场前景
未来研究方向：深入探讨山药多 糖与其他降糖药物的协同作用机 制，为临床治疗提供更多选择
05
山药多糖的安全性评价与质量控制
安全性评价的方法与结果
安全性评价方 法：急性毒性 试验、长期毒 性试验、致畸 致突变试验等
结果：未发现 山药多糖具有 明显的毒性作 用，长期使用
降血糖的临床应用
山药多糖具有调节胰岛素分 泌、促进糖代谢的作用
山药多糖可降低血糖水平， 改善糖尿病症状
怀山药主要成分测定1
第二章：怀山药主要成分测定2.1蛋白质含量测定：凯氏定氮法试样处理:称取0.2g ～2. 00 g固体试样或2. 00 g ～5. 00 g半固体试样或吸取10.00 mL～25. 00 mL液体试样(约相当氮30 mg～40 mg)，移人干燥的100 mL或500 mL定氮瓶中，加人研碎的0.5g硫酸铜,10 g硫酸钾及20 mL浓硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热30分钟。
取下放冷，小心加20mL蒸馏水。
放冷后，移人100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并人容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
同时做试剂空白试验。
测定：装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至三分之二处，加人数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
向接收瓶内加人10 mL硼酸溶液（20g/L）及1滴~2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插人液面下，准确吸取10 mL试样处理液由小漏斗流人反应室，并以10 mL 水洗涤小烧杯使流人反应室内，棒状玻塞塞紧将10 mL氢氧化钠溶液(400 g/L)倒人小玻杯，提起玻塞使其缓缓流人反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。
夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
蒸馏5 min。
移动接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。
然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。
取下接收瓶。
以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0. O5mol/L)滴定至灰色或蓝紫色为终点。
同时准确吸取10 mL 试剂空白消化液按上述操作。
2.2山药多糖的含量测定：多糖含量的测定方法采用苯酚-硫酸法苯酚一硫酸法是利用多糖在浓硫酸水合产生高温的作用下，迅速发生水解反应释放出单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合生成490nm处有最大吸收峰的有色化合物来进行测定的。
山药皮残渣多糖结构表征及抗氧化活性测定
基金项目:河南省自然科学基金(编号:２２２３００４２０５８０);河南省科技攻关项目(编号:２２２１０２１１０３３７)作者简介:杭书扬,男,郑州轻工业大学在读硕士研究生.通信作者:刘延奇(１９６４ ),男,郑州轻工业大学教授,博士.E Ｇm a i l :l i u y a n qi ＠z z u l i ．e d u ．c n 收稿日期:２０２２Ｇ０６Ｇ２７㊀㊀改回日期:２０２２Ｇ１１Ｇ０４D O I :１０．１３６５２/j ．s p jx ．１００３．５７８８．２０２２．８０４７９[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２３)０２Ｇ０１５３Ｇ０６山药皮残渣多糖结构表征及抗氧化活性测定C h a r a c t e r i z a t i o na n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y de t e r m i n a t i o nof p o l ys a c c h a r i d e f r o m y a m p e e l r e s i d u e 杭书扬１HA N GS h u Ｇy a n g１㊀杨留枝１,２,３Y A N GL i u Ｇz h i １,２,３㊀史苗苗１,２,３S H IM i a o Ｇm i a o １,２,３闫溢哲１,２,３Y A N Y i Ｇz h e １,２,３㊀刘延奇１,２,３L I UY a n Ｇqi １,２,３(１．郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州㊀４５０００１;２．食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州㊀４５０００１;３．河南省冷链食品质量安全控制重点实验室,河南郑州㊀４５０００１)(１．C o l l e g e o f F o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g ,Z h e n g z h o uU n i v e r s i t y o f L i g h t I n d u s t r y ,Z h e n g z h o u ,H e n a n ４５０００１,C h i n a ;２．H e n a nC o l l a b o r a t i v e I n n o v a t i o nC e n t e r o f Fo o d P r o d u c t i o na n dS a f e t y ,Z h e n g z h o u ,H e n a n ４５０００１,C h i n a ;３．H e n a nK e y L a b o r a t o r y o fC o l dC h a i nF o o dQ u a l i t y a n dS a f e t y C o n t r o l ,Z h e n gz h o u ,H e n a n ４５０００１,C h i n a )摘要:目的:充分开发山药皮的经济价值.方法:采用水提醇沉法对山药皮和经乙醇提取多酚㊁黄酮的山药皮残渣进行多糖提取,得山药皮多糖(P １)和山药皮残渣多糖(P ２),并分析其结构特征和抗氧化活性.结果:P １㊁P ２得率相差不大,但P ２(３３．５％)的多糖含量约为P １(１７．８％)的两倍;二者均为孔状结构,P ２较P １表面有着更密集的孔洞;P １中主要的单糖为甘露糖㊁葡萄糖及半乳糖,而P ２的为甘露糖;P １㊁P ２不仅存在微晶结构,还存在晶体和非晶结构共存的多晶系统;两种多糖样品具有相同的官能团且均未发现蛋白质;P １㊁P ２中均存在３个螺旋结构,其重均分子量分别为３７１５３．５２和３４６７．３７,此外,P ２的热稳定性不如P １;在０．２~１．０m g/m L 质量浓度范围内,P １㊁P ２的抗氧化活性均随质量浓度的增加而增强,P ２较P １有着更好的抗氧化活性;P １㊁P ２对D P P H 自由基清除率的I C ５０值分别为０．９６４,０．５８６m g /m L ,对羟自由基清除能力的I C ５０值分别为０．９６２,０．７１１m g /m L .结论:经乙醇提取多酚㊁黄酮的山药皮残渣中仍含有丰富的多糖,且P ２较P １有着更好的结构特性和抗氧化活性.关键词:山药;残渣;多糖;结构特征;抗氧化性A b s t r a c t :O b j e c t i v e :T h i s s t u d y a i m e d t o f u l l y d e v e l o p t h e u t i l i z a t i o n v a l u e o f y a m b a r k ．M e t h o d s :T h e e x t r a c t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m y a mb a r k a n d t h e r e s i d u e o f p o l y ph e n o l s a n d f l a v o n o i d s e x t r a c t e d b y e t h a n o l w a s c a r r i e d o u t b y w a t e r e x t r a c t i o na n da l c o h o l p r e c i p i t a t i o n m e t h o d ．T h e p o l y s a c c h a r i d e s o f y a m p e e l (P １)a n d y a m p e e l r e s i d u e (P ２)w e r eo b t a i n e d ．T h e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c sa n da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fP １a n dP ２w e r e a n a l yz e d ．R e s u l t s :T h e y i e l do f P １a n dP ２w e r e s i m i l a r ,b u t t h e p o l y s a c c h a r i d e c o n t e n t o f P ２(３３．５％)w a s a b o u t t w i c e t h a t o f P １(１７．８％)．B o t hP １a n dP ２h a v e l o o s ea n d p o r o u s s t r u c t u r e s,a n dP ２h a sd e n s e p o r e so ni t ss u r f a c e ．M a n n o s e ,g l u c o s e ,a n dga l a c t o s ew e r e t h em a i n m o n o s a c c h a r i d e s i nP １,w h i l e m a n n o s e w a s t h e m a i n m o n o s a c c h a r i d ei n P ２．P １a n dP ２n o to n l y h a v e m i c r o c r y s t a l l i n es t r u c t u r e sb u ta l s oh a v e p o l yc r y s t a l l i n es ys t e m w i t hc r y s t a la n da m o r p h o u ss t r u c t u r e s ．T h et w o p o l y s a c c h a r i d e s a m p l e s h a d t h e s a m e f u n c t i o n a l g r o u p s a n d n o p r o t e i nw a s f o u n d i nb o t ht h es a m pl e s ．B o t h P １a n d P ２h a v et h r e e Ｇh e l i x h e l i x s t r u c t u r e s ,a n d t h e i r a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t i s３７１５３．５２a n d ３４６７．３７,r e s p e c t i v e l y ．P ２i s n o t a s s t a b l e a sP １．I n t h e r a n geo f ０．２~１．０m g/m L ,a n dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fP １a n dP ２i n c r e a s e d w i t ht h e i rc o n c e n t r a t i o n s ．P ２h a d b e t t e ra n t i o x i d a n t a c t i v i t y t h a nP １．T h e I C ５０va l u e s o f t h eD P P Hr a d i c a l s c a v e n g i n g r a t e o fP １a n dP ２w e r e０．９６４a n d０．５８６m g /m L ,r e s p e c t i v e l y ,a n d t h eI C ５０v a l u e so fh y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n g ab i l i t y w e r e ０．９６２a n d０．７１１m g /m L ,r e s p ec t i v e l y ．C o n c l u s i o n :A f t e r e t h a n o l e x t r a c t i o no f p o l y p h e n o l s a nd f l a v o n o i d s ,t he r e s i d u e of y a m p e e l s t i l lc o n t a i n s r i c h p o l y s a c c h a r i d e s ．M o r e o v e r ,P ２h a s b e t t e r s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y t h a nP １．３５１F O O D &MA C H I N E R Y 第３９卷第２期总第２５６期|２０２３年２月|Copyright ©博看网. All Rights Reserved.K e y w o r d s:y a m;r e s i d u e;p o l y s a c c h a r i d e s;s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s;o x i d a t i o n r e s i s t a n c e山药是薯蓣属的一种药食两用植物[１],富含多糖㊁类黄酮㊁多酚㊁尿囊素和其他活性成分[２].在亚洲,尤其是日本和中国,山药被研磨成粉制成面条食用[３],传统的食用过程中所产生的山药皮是其主要残留物,约占山药总重量的１０％~２０％[４].已有研究表明,山药皮生物活性物质含量(尿囊素㊁黄酮㊁多酚等)均高于其果肉[５],在保健食品开发利用方面具有巨大的潜力[６].多糖是由单糖缩合聚合物组成,广泛存在于动物㊁植物和微生物中.近年来,有关山药中非淀粉多糖的提取㊁化学结构及生物活性的研究较多[７],植物源的非淀粉多糖已成为一类重要的生物活性天然产物,在自由基清除剂中发挥重要作用,并逐渐成为一类新型的有效抗氧化剂[８].山药多糖是山药的主要活性成分,主要由甘露糖㊁木糖㊁阿拉伯糖㊁葡萄糖和半乳糖等单糖组成,是一种具有免疫活性的植物多糖[９].目前,对山药多糖的研究主要集中于其果肉多糖,有关山药皮及其抗氧化活性的研究较少.研究拟以山药皮和经乙醇提取多酚㊁黄酮的山药皮残渣为原料,进行多糖提取,得山药皮多糖(P１)和山药皮残渣多糖(P２),同时对P１和P２的单糖组成㊁结构特征及抗氧化活性进行分析,以期为研发新型天然抗氧化产品,增加山药皮经济效益提供依据.１㊀材料与方法１．１㊀材料新鲜铁棍山药:市售;葡萄糖标准品㊁无水乙醇㊁溴化钾㊁硝酸钠㊁叠氮化钠㊁抗坏血酸㊁D P P H㊁复合磷酸盐㊁铁氰化钾㊁三氯乙酸㊁氯化铁㊁硫酸亚铁㊁过氧化氢㊁水杨酸等:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司.１．２㊀仪器与设备循环水式多用真空泵:S H BＧⅢ型,郑州长城科工贸有限公司;色差仪:C R４００型,日本美能达公司;高速离心机:L G１０Ｇ２．４A型,北京医用离心机厂;扫描电子显微镜:T E S C A N M I R A４型,日本R i l i公司;红外光谱仪:B r u k e rT E N S O R２７型,德国布鲁克公司;XＧ射线衍射仪:B r u k e rD８型,德国布鲁克公司;差式扫描量热仪:D S C Q２０型,美国T A公司;综合热分析仪:T G/D T AＧA型,德国耐驰公司;多角度激光散射凝胶渗透色谱:D AWN H E L E O SⅡ型,美国怀雅特公司.１．３㊀方法１．３．１㊀提取工艺㊀山药皮和山药皮残渣磨粉,过８０目筛网,分别称取两种粉末１０g,加入２００m L去离子水,磁力搅拌混匀,５０ħ萃取３h,过滤,重复３次,合并上清液并浓缩至一定体积.自然冷却后,加入４倍体积的无水乙醇,静置２４h,离心,沉淀加少量去离子水溶解,冷冻干燥得粗多糖.将两种粗多糖按m粉末ʒV水为１ʒ１０(g/m L)溶于去离子水,采用S e v a g e法去除蛋白质２次(V多糖溶液ʒV氯仿ʒV正丁醇为１５ʒ３ʒ１).将多糖溶液离心,收集上层水溶液,得到不含蛋白质的多糖溶液,透析,减压浓缩,加入无水乙醇沉淀２４h,离心,沉淀于去离子水中复溶,冻干,得精制多糖P１和P２[１０].１．３．２㊀多糖含量及颜色测定(１)多糖含量:采用苯酚硫酸法[１１].(２)颜色:采用色差仪.１．３．３㊀单糖组成㊀参考文献[１２].１．３．４㊀扫描电镜观察(S E M)㊀用胶带粘取干燥的多糖均匀涂开,并吹去表面多余的样品粉末,然后在真空环境中进行喷金,加速电压３．０k V,选择合适的放大倍数进行拍摄[１３].１．３．５㊀XＧ射线衍射测试(X R D)㊀在工作电压３０k V,电流２０m A,衍射角(２θ)扫描范围１０ʎ~５０ʎ下,进行X R D谱图扫描[１４].１．３．６㊀紫外扫描测试(U V)㊀称取多糖样品５m g,加入５m L去离子水配成１m g/m L样品溶液,扫描范围２００~４００n m,去离子水作空白对照[１５].１．３．７㊀傅里叶红外光谱测试(F T I R)㊀参考文献[１６],分辨率为０．４c m－１,光谱范围为４００~４０００c m－１.１．３．８㊀刚果红试验㊀参考文献[１７],使用紫外分光光度计扫描４００~７００n m范围内的最大吸收波长(λm a x).１．３．９㊀同步热重分析(T G)㊀根据文献[１８],升温范围为５０~６００ħ,升温速率１０ħ/m i n,负载气体为N２.１．３．１０㊀分子量测定㊀采用多角度激光散射凝胶渗透色谱法,将样品溶于去离子水中,配制成质量分数为０．３％的水溶液,流动相为５０mm o l/L N a N O３和０．０２％N a N３的混合溶液,待测样品及流动相经超声㊁抽滤(０．２μm抽滤膜)后进行分析测定[１９].１．３．１１㊀抗氧化能力测定(１)D P P H自由基清除率:参考文献[２０]并修改.取２m L多糖溶液与２m L０．１mm o l/L的D P P HＧ乙醇溶液混匀,３７ħ避光反应３０m i n,以维生素C作阳性对照,测定５１７n m处吸光度,按式(１)计算D P P H自由基清除率.C１＝１－A１－A２A０()ˑ１００％,(１)式中:C１ D P P H自由基清除率,％;A０ 去离子水代替样品的吸光度;A l 样品溶液吸光度;４５１营养与活性N U T R I T I O N&A C T I V I T Y总第２５６期|２０２３年２月|Copyright©博看网. All Rights Reserved.A２ 无水乙醇代替D P P H的吸光度.(２)羟自由基清除率:参考文献[２１]并修改.向试管中分别加入１m L不同浓度的多糖溶液㊁硫酸亚铁溶液(６mm o l/L)和过氧化氢溶液(６mm o l/L),混匀,静置１０m i n,加入１m L水杨酸,轻轻摇动并保持３０m i n,测定５１０n m处吸光度,并按式(２)计算羟自由基清除率.C２＝１－A１－A２A０()ˑ１００％,(２)式中:C２ 羟自由基清除率,％;A０ 对照组(无样品)吸光度;A l 试验组(无水)吸光度;A２ 空白组(不含水杨酸)吸光度.(３)还原力:参考文献[２２].(４)总抗氧化能力:参考文献[２３].１．３．１２㊀数据分析㊀各试验重复３次,采用E x c e l整理数据,I B M S P S SS t a t i s t i c s２２．０软件程序D u n c a n检验法进行显著性分析(P＜０．０５),采用O r i g i n２０２１软件作图.２㊀结果与讨论２．１㊀多糖含量及颜色经测定,P１㊁P２得率分别为(２．６ʃ０．２)％和(２．４ʃ０．１)％,经苯酚硫酸法检测得P２的多糖含量(３３．５％)约为P１(１７．８％)的两倍.经色差仪检测,P２的L∗(７０．３３)值大于P１(６４．０９)的,而其b∗值(１１．７２)小于P１(１３．９３)的,说明P２的颜色比P１白,可能是因为山药皮残渣在提取黄酮㊁多酚过程中被乙醇脱去了部分颜色.２．２㊀单糖组成由表１可知,两种多糖均检测出５种单糖成分(阿拉伯糖㊁木糖㊁甘露糖㊁葡萄糖及半乳糖).P１中主要的单糖为甘露糖㊁葡萄糖及半乳糖,占比分别为(３２．６１ʃ０．６８)％,(３３．４６ʃ０．５９)％,(２２．１９ʃ０．８７)％,此外还含有少量的阿拉伯糖[(７．７０ʃ０．４７)％]和木糖[(４．１０ʃ０．２８)％].而P１的单糖主要为甘露糖和葡萄糖[(１３．８０ʃ０．５２)％],其中甘露糖含量最高,约占P２总单糖的(７０．６１ʃ０．９５)％,阿拉伯糖㊁木糖和半乳糖的含量相对较少,分别为(５．５５ʃ０．２５)％,(６．４４ʃ０．１８)％,(３．７２ʃ表１㊀P１㊁P２的单糖组成†T a b l e１㊀M o n o s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o no fP１a n dP２％单糖P１P２阿拉伯糖７．７０ʃ０．４７b５．５５ʃ０．２５b木糖㊀㊀４．１０ʃ０．２８a６．４４ʃ０．１８b甘露糖㊀３２．６１ʃ０．６８d７０．６１ʃ０．９５d葡萄糖㊀３３．４６ʃ０．５９e１３．８０ʃ０．５２c半乳糖㊀２２．１９ʃ０．８７c３．７２ʃ０．２３a㊀㊀㊀㊀†㊀同列字母不同表示差异显著(P＜０．０５).０．２３)％.二者单糖成分差异很大,可能是提取山药皮多酚㊁黄酮时,提取溶液对P２的单糖组成有一定的影响,需后续进一步探究.２．３㊀S E M结果由图１可知,P１㊁P２均为疏松㊁多孔状结构,P２表面有着密集细小的孔洞,可能是因为山药皮残渣在乙醇提取多酚㊁黄酮过程中,多糖与多酚之间作用力消失所造成的.多糖表观结构的不同可能造成其分子量差异[２４],P１㊁P２表面样貌的差异也可能导致两种样品分子量的差异.２．４㊀X R D结果由图２可知,两种多糖在１５ʎ,２０ʎ,３２ʎ附近有较强的吸收峰,P２和P１有着相同的峰型,但P２各吸收峰强度大于P１,表明山药皮多糖中不仅存在微晶结构,还存在晶体和非晶结构共存的多晶系统.２．５㊀紫外扫描结果由图３可知,两种多糖在２６０~２８０n m处均未检测到紫外吸收峰,说明多糖中不存在蛋白结构,表明经S e v a g e试剂处理后,两种多糖样品均不含蛋白质.２．６㊀F TＧI R图谱分析由图４可知,P２峰型比P１的更加明确,特征官能团更为突出,进一步表明P２的多糖含量与品质较P１有一图１㊀扫描电子显微镜图F i g u r e１㊀S c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e i m a g e s(ˑ１０００)图２㊀P１㊁P２的X射线衍射图谱F i g u r e２㊀XＧr a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s o fP１a n dP２５５１|V o l．３９,N o．２杭书扬等:山药皮残渣多糖结构表征及抗氧化活性测定Copyright©博看网. All Rights Reserved.图３㊀P１㊁P２的紫外光谱图图的红外光谱图F i g u r e４㊀I n f r a r e d s p e c t r a o fP１a n dP２定程度的提高.３４０２c m－１处有较宽㊁较强的谱带,该谱带归属于 OH的伸缩振动;２９３５c m－１处弱峰属于C H反对称拉伸振动;１６２５c m－１处出现不对称的拉伸峰,表明多糖中存在羧基,这与多糖中的水有关[２５];１４１３c m－１处为C H剪切振动的特征吸收峰;１２００~１０００c m－１的波段被指定为C O C键和糖苷桥[２６]的价振动,１１５４c m－１处为O H剪切振动峰值;１０２４c m－１处为C O C拉伸振动峰值[２７].２．７㊀刚果红试验结果具有三螺旋结构的多糖在碱性条件下能与刚果红形成络合物,其最大吸收波长(λm a x)随碱溶液浓度的增加而红移,分子间和分子内氢键断裂,并发生了从三螺旋到单螺旋的构象转变[２８].由图５可知,与对照组相比,多糖溶液的λm a x红移,说明P１㊁P２均存在三螺旋结构.此外,随着N a OH浓度的增加,各多糖的λm a x下降.２．８㊀T G结果由图６可知,两种多糖具有相似的失重曲线形态,其失重过程可分为３个阶段:①３０~２００ħ阶段,样品重量略有下降,可能是多糖失去了束缚水[２９];②２００~４８０ħ阶段,多糖快速失重,其重量开始急剧下降,可能是由多糖的解聚和分解引起的[３０],多糖的大部分重量损失发生在该区域;③４００~６００ħ阶段,由于多糖完全分解,样品图５㊀不同浓度N a OH下刚果红多糖混合物的最大吸收波长F i g u r e５㊀M a x i m u ma b s o r p t i o nw a v e l e ng t ho fC o n g o r e dp o l y s a c c h a r i d e m i x t u r e a t d i f f e r e n t图的图F i g u r e６㊀T Gd i a g r a m s o fP１a n dP２的失重变得缓慢.P１㊁P２最终重量分别降至其初始重量的６１．１１％,５１．０４％,说明P２的热稳定性不如P１.２．９㊀分子量分析多糖的分子量(M w)是影响水溶液中多糖构型和形态的主要因素之一,并参与蛋白质 碳水化合物相互作用,影响其生物活性.由图７可知,多糖P１㊁P２分别在横坐标为４．５７,３．５４时出峰,其重均分子量分别为３７１５３．５２,３４６７．３７.２．１０㊀抗氧化试验２．１０．１㊀D P P H自由基清除率㊀由图８可知,当样品质量浓度为０．２~１．０m g/m L时,D P P H自由基清除能力与多糖㊁维生素C质量浓度呈正相关,P２各浓度下的清除率均显著强于P１,但是P１㊁P２的清除率均显著低于维生素C.P１㊁P２和维生素C的I C５０值分别为０．９６４,０．５８６,０．０１６m g/m L,D P P H自由基清除率强弱顺序为维生素C＞P２＞P１,说明多糖具有一定的D P P H自由基清除率,与林军等[３０]的研究结论一致.２．１０．２㊀羟自由基清除率㊀由图９可知,当样品质量浓度为０．２~１．０m g/m L时,P１㊁P２和维生素C的羟自由基清６５１营养与活性N U T R I T I O N&A C T I V I T Y总第２５６期|２０２３年２月|Copyright©博看网. All Rights Reserved.除能力随溶液质量浓度的增大而增强,与张秋红[３１]的研究结论一致.P １㊁P ２和维生素C 的I C ５０值分别为０．９６２,０．７１１,０．４５０m g /m L ,表明P ２的羟自由基清除能力强于P １,但不如维生素.图７㊀P １㊁P ２的分子量分布图F i g u r e２小写字母不同表示差异显著(P ＜０．０５图８㊀P １㊁P ２和维生素C 对D P P H 自由基清除率的影响F i gu r e ８㊀E f f e c t s o fP １,P ２a n dv i t a m i nCo nD P P H小写字母不同表示差异显著(P ＜０．０５)图９㊀P １㊁P ２和维生素C 对羟自由基清除率的影响F i g u r e ９㊀E f f e c t s o fP １,P ２a n dv i t a m i nCo nh y d r o x yl r a d i c a l s c a v e n g i n g ra t e ２．１０．３㊀还原力与总抗氧化能力㊀由图１０和图１１可知,两种多糖在各浓度水平下的还原力(抗氧化能力)均不如维生素C ,在试验质量浓度范围内,随着质量浓度的增加,样品的还原力(抗氧化能力)随之显著增强,当样品质量浓度为１m g /m L 时,P ２的还原力(抗氧化能力)显著强于P １.小写字母不同表示差异显著(P ＜０．０５图１０㊀P １㊁P ２和维生素C 的还原力F i g u r e １０,小写字母不同表示差异显著(P ＜０．０５图１１㊀P １㊁P ２和维生素C 的总抗氧化能力F i g u r e １１㊀T o t a l a n t i o x i d a n t c a p a c i t y ofP １,P ２a n dv i t a m i nC３㊀结论以山药皮和山药皮残渣为原料进行多糖提取,并对其提取物的结构和抗氧化性进行分析.结果表明,山药皮残渣中多糖提取得率与山药皮中相差不大,且山药皮残渣多糖较山药皮多糖有着糖含量高㊁色泽亮度强㊁比表面积大㊁重均分子量小㊁抗氧化能力强等优势.虽然山药皮残渣多糖具有良好的抗氧化能力,但是未能确定其发挥抗氧化活性成分的关键物质,后续可通过分离纯化技术来进一步研究.参考文献[1]HUANG H,JIANG Q,CHEN Y ,et al.Preparation,physic Ｇchemical ７５１|V o l ．３９,N o ．２杭书扬等:山药皮残渣多糖结构表征及抗氧化活性测定Copyright ©博看网. 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山药多糖rdps-i的结构分析及抗肿瘤活性
山药多糖Ρ∆ΠΣ2Ι的结构分析及抗肿瘤活性赵国华 3 李志孝 陈宗道西南农业大学食品科学学院 重庆 兰州大学应用有机化学国家重点实验室 甘肃兰州摘要 目的研究山药多糖的化学结构和抗肿瘤活性∀方法用水提取山药块茎粗多糖 经≥ √ 反复脱蛋白 次 透析后经⁄∞ ∞2 ∏ 及≥ ¬ 2 柱色谱纯化得山药多糖 ⁄°≥2 ∀经完全酸水解!部分酸水解 用°≤ ≤ 高碘酸氧化 ≥ 降解 甲基化分析 及 ≤ 等研究山药多糖的化学结构∀并用小鼠移植性实体瘤研究了 ⁄°≥2 的体内抗肿瘤作用∀结果 ⁄°≥2 的分子量为 比旋光度为≈Α⁄1 β 1 特性粘度为≈Γ 1 ≅ # ∀ ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖以 Β 1 Β 1 的摩尔比组成 以Α2∆2 ψ 2 为主链 在 2Ο位有Α2∆2 ψ 2 2Β2∆2 2 支链的杂多糖∀ ⁄°≥2 对移植性黑色素 和 肺癌有很强的抑制作用∀结论 ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖构成的杂多糖 有很强的体内抗肿瘤活性∀关键词 山药 多糖 结构 抗肿瘤中图分类号 文献标识码 文章编号 ΣτρυχτυραλαναλψσισανδαντιτυµοραχτιϖιτψοφΡ∆ΠΣ2ΙπολψσαχχηαριδεφροµΧηινεσεψαµ∏ 2 ∏ 2¬ ≤ ∞ 2(1.ΦοοδΧολλεγε,Σουτη2ΩεστΑγριχυλτυραλΥνιϖερσιτψ,Χηονγθινγ400716,Χηινα;2.ΝατιοναλΛαβορατορψοφΑππλιεδΟργανιχΧηεµιστρψ,ΛανζηουΥνιϖερσιτψ,Λανζηου730000,Χηινα)Αβστραχτ Αιµ× ∏ ∏ ∏ ∏ √ ≤ Μετηοδσ× ∏ ≤ ¬ ¬ ⁄°≥2 ∏ ∏ ≥ √ ⁄∞ ∞2 ∏ ≥ ¬ 2 ∏ ∏ ∏ °≤ ≤ ¬ ≥ ≤ × ∏ √ ινϖιϖο ∏ ¬ Ρεσυλτσ ⁄°≥2 ∏ Β 1 Β 1 Α2∆2 2 Α2∆2 ψ 2 2Β2∆2 2 ∏ ≈Α ⁄ 1 β 1 ≈Γ 1 ≅ # ⁄°≥2 ∏ ∏ ινϖιϖο Χονχλυσιον ⁄°≥2 ∏ √Κεψωορδσ ≤ ∏ ∏ ∏山药是传统药食同源食物 为薯蓣科薯蓣属植物 ∆ιοσχορεαοπποσιτα× ∏ 的块茎 有益肾气!健脾胃!止泻痢和化痰涎之功效∀其水煎剂有延缓衰老!收稿日期 2 2基金项目 国家自然科学基金重点资助项目3通讯作者× ƒ ¬∞2 ∏ ∏ ∏ 防治糖尿病!抗突变及降血糖等作用 对其皂苷及尿囊素等成分的研究已有报道≈ ∀其总多糖有明显的抗氧化!增强免疫调节作用≈ 但对其多糖组分的纯化!化学结构和抗肿瘤活性尚未见报道∀为促进对山药多糖的进一步开发和应用 本文对其主要多糖 ⁄°≥2 的分离纯化!化学结构及抗肿瘤活性进行了研究∀##药学学报 ° ∏ ≥材料和方法仪器 ≥÷型红外光谱仪 ≥ ∏ ≤2 型气相色谱仪 ∂2 石英毛细管柱 1 ≅ ∏ 2 型超导核磁共振仪 ° Π 型色质联用分析仪 ° 型旋光仪 • 型高压液相色谱仪 ≥2 柱 ≥ ¬ ≥∞2 型示差检测仪∀试剂⁄∞ ∞2 ∏ ⁄∞2 为• 产品 ≥ ¬ 2 及⁄ ¬ 系列标准品为° 产品 三氟醋酸 标准单糖和糖醇为∞ 产品 硼氢化钠为 产品∀1山药多糖的化学结构提取与纯化山药 干重 粉碎 经乙醚脱脂后用水浸提 离心除去淀粉 上清液真空浓缩后 用≥ √ 法脱蛋白 次 置透析袋中对自来水透析 透析内液真空浓缩至一定体积 加乙醇沉淀 离心收集白色沉淀 溶剂干燥得山药粗多糖 1 ∀取山药粗多糖 用⁄∞ ∞2纤维素柱纯化 水洗脱 分部收集 主峰多糖乙醇沉淀 干燥得 ⁄°≥ 1 ∀取 1 ⁄°≥再经≥ ¬ 2 凝胶色谱柱纯化 蒸馏水洗脱 主峰多糖乙醇沉淀 冷冻干燥后得 ⁄°≥2 多糖 1 ∀纯度及分子量测定用高压液相色谱法 分析柱为 ≥2 柱 洗脱剂为双蒸馏水 流速为 1 # 常温测定∀样品 ⁄°≥2 及⁄ ¬ 系列标准品分别经 ° ≤分离 根据洗脱峰的形状判断样品的纯度 以⁄ ¬ 系列标准品的分子量对数与对应的洗脱体积作标准曲线 再根据 ⁄°≥2 的洗脱体积求得其分子量∀糖组成测定≈ ∗ ⁄°≥2 加 # 三氟醋酸 ׃ 封管后在 ε水解 冷却后减压蒸干除去׃ ∀用纸色谱法 °≤ 检测水解产物 展开剂为乙酸乙酯2吡啶2醋酸2水 Β Β Β 用苯胺2邻苯二甲酸试剂显色∀剩余水解物减压干燥过夜后加入盐酸羟胺 及无水吡啶 溶解后在 ε反应 冷至室温 加入无水醋酸酐 在 ε下继续反应 冷至室温 加入 摇匀 用氯仿萃取乙酰化产物进行气相色谱 ≤ 分析∀部分酸水解取 ⁄°≥2 用 1 # 的׃ 封管 置烘箱中在 ε水解 减压蒸干 再加甲醇 蒸干 重复 次 将׃ 去除干净∀水解物加水溶解后于透析袋中处理 袋外部分浓缩后干燥得 ⁄°≥2 2 组分 袋内部分浓缩后再经≥ ¬ 2 柱纯化后得 ⁄°≥2 2 组分 对 ⁄°≥2 2 和 ⁄°≥2 2 进行糖组成分析和甲基化分析∀甲基化反应取经°干燥的 ⁄°≥2 溶于无水二甲亚砜 中 在氩气保护下注入甲基亚磺酰负离子 1 室温反应 ∀置于冰浴至内容物冻结 滴加碘甲烷 ∀封口后在室温下反应 ∀用氩气将碘甲烷驱净∀加水 用氯仿萃取甲基化产物 次 每次 合并氯仿层用水洗 次 加无水硫酸钠过夜∀过滤除去无水硫酸钠 减压蒸去氯仿 真空干燥得暗黄色的甲基化产物 经红外光谱确认样品甲基化完全后 相继用甲酸和 # ׃ 水解并乙酰化 产物加氯仿 1 溶解 即可进行 ≤及 ≤2 ≥分析≈ ∀高碘酸氧化及Σµιτη降解取 ⁄°≥2 加 1 # 高碘酸钠 ε暗处进行氧化反应 分光光度法 间断检测反应过程 待反应完全后 按文献≈ 处理反应液 经完全酸水解! 还原!乙酰化后进行 ≤分析∀ΙΡ,1ΗΝΜΡ及13ΧΝΜΡ光谱分析取 ⁄°≥2 与 压片后在 ≥÷红外光谱仪常规测定∀另取 ⁄°≥2 溶于⁄1 中 测定 及 ≤ ∀2山药多糖的抗肿瘤活性≈取小鼠体内传代的 黑色素瘤细胞或 肺癌细胞瘤块 称重 分别用 ° 培养液稀释按质量浓度制成 Β 和 Β 的细胞悬液 1 Π只 接种于试验≤ Π 小鼠右前肢腋部皮下∀接种后 开始每天给予低剂量组 ⁄ !中等剂量组 ⁄ 和高剂量组 ⁄ 分别为 和 # 的多糖受试物 次 对照组 ≤ 给予等量的生理盐水 连续 周 结束后 颈椎脱臼处死小鼠 先称体重 再小心剥出肿瘤组织并称重 按下式计算体内肿瘤抑制率∀结果与讨论1Ρ∆ΠΣ2Ι的化学结构山药块茎粉碎后经热水浸提!乙醇沉淀!脱蛋白得 ⁄°≥粗多糖∀经⁄∞ ∞2纤维素离子交换色谱及≥ ¬ 2 柱色谱进一步分离纯化 得白色无定形粉末状多糖 ⁄°≥2 ∀ ⁄°≥2 溶解后经 ° ≤色谱得到其洗脱曲线是一对称的单一峰 图 证明 ⁄°≥2 已是均一多糖∀元素分析此多糖不含氮 比##药学学报 ° ∏ ≥旋光度为≈Α ⁄ 1β 1 特性粘度为≈Γ 1 ≅#° ≤测得其分子量为∀ƒ ∏ ° ≤ ⁄°≥2⁄°≥2 经完全酸水解产物用°≤法检测发现有葡萄糖!甘露糖和半乳糖的斑点 表明 ⁄°≥2 是一种杂聚糖图 是标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物的 ≤图 按出峰的先后依次为鼠李糖!岩藻糖!阿拉伯糖!木糖!甘露糖!葡萄糖!半乳糖和内标肌醇∀图 是 ⁄°≥2 完全水解物的糖腈乙酸酯衍生物的 ≤图 表明 ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖组成 摩尔比为 Β 1 Β 1∀ƒ ∏ ≤ ∏ ⁄°≥2 甲基化产物水解!还原!乙酰化后进行 ≤2 ≥分析 数据与文献≈ 对照结果见表 ∀Ταβλε1 ΤηερεσυλτσοφµετηψλατεδαναλψσισοφΡ∆ΠΣ2Ιανδιτσηψδρολψσατεσ∏×3≥Π2 2∂ 2 ψ2 22 ψ 2 2ψ 2 2 ψ 2 2ψ 2 2 ψ2 2ψ 2 2 ψ×3√2Ο2 2 2 2 由表 可知 ⁄°≥2 主要是以 2连接的葡萄糖残基为主∀ ⁄°≥2 部分酸水解后获得两个组分 ⁄°≥2 2 为透析袋外的部分 糖组成分析发现只有甘露糖和半乳糖 甲基化分析为 2 2 和 2 2 及 2 2 Β Β ∀ ⁄°≥2 2 为透析袋内部分纯化得到的多糖 糖组成分析发现只含葡萄糖甲基化分析其连接方式为 ψ 连接的葡聚糖分子量约为 ∀由此可以初步认为 ⁄°≥2 的主链是 ψ 连接的葡聚糖 侧链由甘露糖和半乳糖构成 其连接方式为 ψ 连接∀在 2位连有低聚甘露半乳糖分支∀ ⁄°≥2 经高碘酸氧化 每摩尔己糖残基消耗 1 理论值为 1生成甲酸 1 理论值为 1 ≈ ∀≥ 降解产物经 ≤分析发现主要为葡萄糖和甘油 葡萄糖是 2葡萄糖残基和2葡萄糖残基的降解产物 而甘油是 2半乳糖残基和 2甘露糖残基的降解产物∀这与甲基化分析的结果相吻合∀图 是 ⁄°≥2 的 ≤ 图谱 经与文献≈ ∗ 比较 将其碳信号归属于表 ∀Ταβλε2 Ασσιγνµεντοφ13ΧΝΜΡχηεµιχαλσηιφτσοφΡ∆ΠΣ2Ι≥∏ ∏ ≤≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ Α ψ Α ψ Α ψ Β ψ2图 中≤ 的 个强吸收峰都在∆ ∆ 11 1 以下在 ⁄°≥2 的图 中有 个强吸收峰也都处在∆ 1 ∆ 1 11 以上表明 ⁄°≥2 的糖苷键类型主要是Α2型 但同时也发现在 ⁄°≥2 的 ≤ 谱中有 个较弱的≤ 信号处在∆ ∆ 1 以上 在 中也有 个 信号处在∆ 1 ∆ 1 以下 表明 ⁄°≥2 的糖苷键中也存在少量的Β2构型 Α2型≤ 信号在∆ 以下 信号在∆ 1 以上 Β2型≤ 信号在∆ 以上 信号在∆ 1 以下 ≈ ∀在 ⁄°≥2 的红外光谱 图 中 1 1 和 1的吸收峰表示 ⁄°≥2 中的糖环构型为吡喃型 呋喃型糖环在此区间上只有两个强吸收峰 而 1的吸收峰是∆2吡喃葡糖的非对称环伸缩振动的特征吸收峰∀ 1是甘露糖的特征吸收峰≈∀##赵国华等 山药多糖 ⁄°≥2 的结构分析及抗肿瘤活性ƒ ∏≤ ∏ ⁄°≥2ƒ ∏∏ ⁄°≥2ƒ ∏ ∏ ⁄°≥22 Ρ∆ΠΣ2Ι的抗肿瘤活性由表 可见 #⁄°≥2 对 肺癌有显著地抑制作用 而对 黑色素瘤没有明显作用 等于或高于 # 的 ⁄°≥2 对 黑色素瘤和 肺癌都有显著的抑制效果且中等剂量 #作用最佳∀Ταβλε3 ΙνηιβιτορψεφφεχτοφΡ∆ΠΣ2Ιονχανχερχελλινµιχεινϖιϖο≤ ∏ ×∏ Π Π≤ ?⁄ ? ⁄ ? 333 ⁄? 33∏ ≤ ? ≤⁄ ? 33 ⁄ ? 333 ⁄? 333ν ξ?σ33Π 1 ϖσ ≤ 333Π 1 ϖσ ≤Ρεφερενχεσ≈ ∏ ƒ ⁄ ÷ εταλ √≈ ΧηινΤραδιτΗερβ∆ρυγσ 中草药 24≈ • ≠ ÷ εταλ × ∏ ∏∏ ≤ ≈ ΑχταΝυτρΣιν 营养学报 24≈ ÷ ∏ƒ ≤ ≠ ≤ ∏ ∏ ∏Ποδοπηψλλυµοµοδι• √ σπραθυε≈ ΑχταΧηεµΣιν 化学学报 54≈ ° √ ⁄ ∞ °⁄ εταλ∏ 2 2 ∏ ≈ ΧαρβοηψδρΡεσ 5≈ ÷ ∏ ≤ ≤ ≠ εταλ × ∏ ∏¬ √ √ Ασπαραγυσχοχηινχηινενσισ≈ ΑχταΠηαρµΣιν 药学学报 35≈ ≥√ ≥≈ ΧαρβοηψδρΡεσ 5≈ ƒ ≈##药学学报 ° ∏ ≥ΦορειγνΜεδΣχι Πηαρµ 国外医学2药学分册 4≈ • ΜετηοδσινΧαρβοηψδρατεΧηεµιστρψ ςολ ΓενεραλΠολψσαχχηαριδε ≈ ≠ °≈ ∏ ≤ ∏ ∞ ∏ ∏ √ ≈ ΙντϑΧανχερ 8≈ ƒ ∏ ∏ ¬≈ ΧηεµΙνδ Λονδον 7≈ ° ∏ ∏ ∏ ≈ Πηψτοχηεµιστρψ32≈ • ΒιοχηεµιχαλΡεσεαρχηΜετηοδοφΓλψχοχονυγαλεσ 复合多糖生化研究技术 ≈ ∏ √ °≈ ° ≤ 2 ∏ ≈ ΑδϖΧαρβοηψδρΧηεµΒιοχηεµ 38##赵国华等 山药多糖 ⁄°≥2 的结构分析及抗肿瘤活性。
山药多糖RDPS_I组分的纯化及理化性质的研究_赵国华
山药多糖RDPS -I 组分的纯化及理化性质的研究＊赵国华1 李志孝2 陈宗道11(西南农业大学食品科学学院,重庆,400716)2(兰州大学应用有机化学国家重点实验室,兰州,730070)摘 要 山药经水浸提分离,浸提液脱蛋白,透析,乙醇沉淀物经DE AE -52纤维素及Sephadex G -100色谱纯化得白色粉末状多糖RDPS -I 。
Sepharose CL -6B 凝胶色谱分析表明RDPS -I 为多糖纯品。
定性化学反应表明RDPS -I 不含核酸、蛋白质、酚类物质和糖醛酸,是一种非淀粉类中性纯粹多糖,比旋光度[α]22D (H 2O )为+188.4(c =0.8),特性粘度[η]为16.48×10-3(mL /g ),相对分子质量为42200,完全酸水解后纸层析及气相色谱分析确定RDPS -I 的糖基组成为葡萄糖、甘露糖和半乳糖,摩尔比为1∶0.37∶0.11。
关键词 山药,多糖,理化性质 第一作者:博士,讲师。
＊国家自然科学基金重点资助项目(No .39730480) 收稿时间:2002-01-11,改回时间:2002-09-08 山药,拉丁名为Dioscorea opposita Thunb ,薯蓣科薯蓣属植物,《本草纲目》对其的记载是“益肾气,健脾胃,止泻痢,化痰涎,润皮毛”,现代医学研究表明,山药具有多种生物活性,如延缓衰老[1],防治糖尿病,抗氧化,促进免疫功能[21],抗突变[3],降血糖[4]等功能。
并认为山药中的主要功效成分是山药多糖。
但有关山药多糖的分离纯化和理化性质只有一些较为粗略的研究报道,缺乏系统而深入的研究。
本文详细研究了山药水溶性多糖组分RDPS -I 的分离纯化方法和它的理化性质,为山药多糖的进一步研究和利用奠定了基础。
1 材料与方法1.1 供试材料山药,由西南农业大学实验农场提供。
1.2 主要试剂DE AE -纤维素(DE -52)为Whatman 公司产品,Sephadex G -100,Sepharose 和已知分子质量的Dextran 为Phar macia 公司产品,标准单糖为E .Merck 公司产品。
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山药多糖的结构鉴定
摘要：本实验对新鲜山药分离纯化得到的多糖进行结构表征。
通过对山药多糖的结构分析，为进一步利用山药开发医药、保健食品提供基础。
通过标准曲线分析得到山药多糖的糖醛酸含量为12.0%，乙酰基含量为18.5%。
傅立叶红外光谱结果分析表明多糖中含有糖醛酸，与化学法分析结果一致。
气相色谱-质谱联用分析结果显示山药多糖是由两种单糖组成的杂多糖，分别为葡萄糖和半乳糖，且摩尔比为1.52：1。
将样品甲基化后进行GC-MS分析得到3种类型的残基组成，分别为1,3-葡萄糖残基、-1-半乳糖残基、-1,6-半乳糖残基。
关键词：山药多糖；结构；仪器分析
STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF POL YSACCHARIDE FROM CHINESE YAM
Abstract: The structure characterization of polysaccharide from Chinese Yam was analyzed in this study, which can support further development as healthcare food and pharmaceuticals in the future. The main contents and results are as follows: The chemical analysis results showed that the pure polysaccharide contained 12.0% uronic acid and 18.5% acetyl. Fourier infrared transformation analysis showed that the purified polysaccharide had the characteristic absorptive peaks, and that it contained uronic acid. Based on methylation and GC-MS analysis, the purified polysaccharide was composed of glucose and galactose with a molar ratio of 1.52:1, mainly including 1,3-linked-glc, 1-linked-gal and 1,6-linked-gal.
Keywords: Yam polysaccharide; structure; instrumental analysis
1．引言
1.1 研究背景及意义
山药是薯蓣属植物的地下块茎。
由于其具有“补肾气，养脾胃，止泻痢，化痰涎，润毛发”的功效，使得山药既成为常见的餐桌菜肴，又是一味重要的中药。
山药药食两用的保健功效和可口风味，深得人们的喜爱，也因此催生了许多基于山药活性成分的研究，如医药、保健产品的开发。
研究发现山药含有丰富的基本营养素，还含有皂苷、糖蛋白、胆碱、植酸、多巴胺、多酚氧化酶、黄酮类化合物等多种活性物质，具有降血脂、降血糖、调理肠胃、抗氧化、防衰老、抗突变
活性和抗肿瘤、调节免疫力和体内酸碱平衡等诸多功效[1]。
山药多糖也是主要的活性成分之一，近年来被广泛开发。
其组成为甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，具有多种生理活性，例如降血脂、降血压、抗衰老等[2]。
由于提取方式的不同，山药多糖在结构、活性方面存在较大差异。
本实验的重点是对山药多糖结构的鉴定。
多糖的结构分析主要包括：（1）测定多糖相对分子质量；（2）单糖组成及各成分的摩尔比；（3）常规官能团和取代基；（4）单糖残基组成、顺序及连接位置；（5）多糖糖环的构型、端基异头碳的构型；（6）多糖分子的空间构象、多糖分子与分子间相互作用等内容。
组成多糖的单糖种类、侧链组成各异，单糖的连接顺序、连接位置也千差万别，因此多糖的结构鉴定十分困难。
要完全明确一个多糖分子的结构需要结合各种方法进行综合分析。
针对山药多糖的研究，国内外大多数的实验是关于山药多糖的提取方法的优化、不同分离纯化方法的比较、各种生物活性的探究这几个方面。
但是关于山药多糖结构的研究主要是对于其单糖组成成分和各组分含量的分析，对于其结构的较为详细、全面的分析则相对较少。
况且，多糖的结构与其功能的发挥和效用的最大化利用有着密切的联系。
因此，通过对山药多糖结构的深入剖析能更好地促进山药多糖在医药、食品、保健药品等方面的产品开发和深加工。
1.2 研究现状
对于多糖的结构分析分为一级结构鉴定：多糖的纯度、分子量、单糖残基组成、单糖残基的连接位置及顺序、糖苷键的构型；还包括对多糖分子空间构象、多糖分子在空间上的相互作用等高级结构的研究。
由于纯化得到的山药多糖样品珍贵，结构鉴定又相对复杂（即使是一级结构），在实际研究过程中不仅要借助各种现代化的仪器分析，还需要结合化学方法才能较准确地对山药多糖的结构进行鉴定。
多糖结构的分析方法主要有化学分析法、仪器分析法、生物分析法。
化学分析法包括水解法、Smith 降解法、高碘酸盐氧化法、甲基化反应和气相色谱-质谱联用等。
仪器分析法则采用红外光谱法( IR) 、质谱法( MS) 、气相色谱法( GC) 、高效液相色谱法( HPLC) 对其进行分析。
生物学方法分为酶学法和免疫学法。
得益于高场核磁共振技术、质谱技术、免疫生物化学、PCR等现代化高。