EMSA技术简介
凝胶滞缓实验 学习笔记
凝胶滞缓实验姓名：范杰林学号：0806604204 班级：08生物技术二班定义：凝胶滞缓实验（EMSA）是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。
历史：最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性分析，也可以用于定量分析，但定量分析较难。
这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中裸露的DNA朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比。
因此，没有结合蛋白质的DNA片段移动速度快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而移动的慢。
于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。
实例：在EMSA试验中，用放射性同位素标记待检测的DNA片段（及探针DNA），然后与细胞提取物共温育，形成DNA-蛋白质复合物，将该复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，结束后用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。
如果细胞蛋白提取物中没有能与DNA探针特异性结合的蛋白质，那么所有的放射性标记就会出现在凝胶带底部，反之则将形成DNA—蛋白质复合物而受到凝胶阻滞，放射性标记的DNA条带将出现在凝胶的不同位置而被分离（如下图所示），从而达到分离纯化特定的结合蛋白的目的。
如果在DNA-蛋白质复合物中放放入超量的非标记竞争DNA分子，如果它与标记的探针DNA结合同一种蛋白质，由于竞争DNA（非标记）远远多于探针DNA（标记），按动力学原理，绝大部分蛋白质会与竞争DNA结合，使绝大多数探针DNA处于自由状态，凝胶电泳放射自显影图上不会出现阻滞条带。
相反，如果竞争DNA不与探针DNA所结合的蛋白质发生相互作用，则在自显影图上仍会出现阻滞条带。
通过设计一系列引入一个或数个突变碱基的放射性标记探针，可用EMSA来评估这些突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响，进而确定该探针DNA分子中于蛋白质直接发生相互作用的关键性碱基（如下图所示），用于研究与蛋白质结合的DNA序列特异性。
EMSA技术的原理
概述EMSA (Encoder-Modulator-Sampler-Adversary) 技术是一种用于数据隐写的通用方法。
它可以隐藏消息在一个密文中，使得仅有授权的接收方能够解读。
EMSA技术的基本原理包括以下几个步骤：编码、调制、采样和对抗。
在EMSA技术中，编码步骤将明文消息转换为一个二进制序列，以便嵌入到密文中。
调制步骤将这个二进制序列转换为一系列的密文符号，即将消息隐藏在密文中。
采样步骤在调制后的信号中进行采样，以便提取出隐藏的消息。
对抗步骤是为了保护隐藏的消息免受攻击者的窃取，通过引入噪音来增强隐藏的隐写信息。
在下面的文章中，我们将详细介绍每个步骤的原理，并说明它们如何协同工作以实现数据隐写的目的。
编码编码是EMSA技术的第一个步骤，它负责将明文消息转换为一个二进制序列。
通常，这个过程涉及到将明文消息进行编码，以便它可以稍后嵌入到密文中。
编码器的目标是将明文消息转换为一系列具有统计保密性的二进制位。
在编码步骤中，可以使用各种编码算法，如哈夫曼编码、RLE编码等。
这些编码算法可以将明文消息表示为一个更紧凑的二进制形式，减少占用的存储空间。
在选择编码算法时，需要考虑到编码的准确性、速度和存储效率。
调制调制是EMSA技术的第二个步骤，它负责将编码后的二进制序列转换为一系列的密文符号。
调制器的目标是将消息隐藏在一个看起来与原始信号无关的形式中，以迷惑攻击者。
在调制步骤中，可以使用各种调制技术，如振幅移位键控 (ASK)、频率移位键控(FSK)、相位移位键控 (PSK) 等。
这些调制技术可以将二进制序列映射到不同的信号特性中，比如振幅、频率或相位。
根据不同的调制技术，调制可以是线性的或非线性的。
采样采样是EMSA技术的第三个步骤，它负责从调制后的信号中提取隐藏的隐写信息。
采样器的目标是以最小的误差率从复杂的信道中恢复出隐藏的消息。
在采样步骤中，通常会使用采样定理来决定采样率。
采样定理指出，为了能够准确还原原始信号，采样率必须高于信号中最高频率的两倍。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
emsa竞争探针原理(二)
emsa竞争探针原理(二)EMSA竞争探针原理引言•EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与DNA相互作用的原理和机制。
•EMSA竞争探针原理也是EMSA技术中的一种应用，用于研究蛋白质竞争结合DNA的能力和亲和性。
EMSA竞争探针原理概述•EMSA竞争探针原理基于蛋白质与DNA相互作用导致DNA的减缓迁移速度的特性。
•EMSA竞争探针实验基本步骤：准备探针、制备核酸蛋白质复合物、竞争试剂的加入、电泳分离、探针信号的检测与分析。
EMSA竞争探针原理详解准备探针•控制探针：探针序列与研究对象的DNA结合区相同。
•标记探针：在探针的某个位置引入放射性或荧光标记物，便于后续分析。
制备核酸蛋白质复合物•核酸蛋白质复合物的制备：将研究对象的核酸序列与目标蛋白质进行混合反应，形成复合物。
竞争试剂的加入•竞争试剂：与目标蛋白质竞争结合DNA的物质，可为非特异性的DNA片段或具有类似结构的DNA序列。
•竞争试剂的加入：在制备核酸蛋白质复合物的过程中，将竞争试剂与核酸蛋白质混合。
电泳分离•核酸蛋白质复合物的电泳：将制备好的复合物样品经过电泳分离，让其在凝胶上移动。
探针信号的检测与分析•探针信号的检测：利用放射性示踪物或荧光标记等进行信号的检测。
•探针信号的分析：通过观察探针在凝胶上的位置、强度等信息，分析蛋白质与DNA相互作用的强弱和特异性。
EMSA竞争探针原理的意义•EMSA竞争探针原理为研究蛋白质的功能和调控机制提供了有效的工具。
•EMSA竞争探针原理的应用广泛，可以用于筛选与目标蛋白质相互作用的分子、探究基因调控的机制等。
总结•EMSA竞争探针原理通过探究蛋白质竞争结合DNA的能力和亲和性，为我们深入了解蛋白质与DNA相互作用提供了有力的方法。
•EMSA技术的发展和应用将进一步推动生物医学研究的进展，并为疾病治疗和药物开发提供新的思路和方法。
凝胶迁移(EMSA)实验总结
EMSA实验总结实验原理：凝胶迁移实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究蛋白与核酸（DNA/RNA）相互作用的技术。
实验步骤：（参考碧云天化学发光法EMSA 试剂盒）1.蛋白：利用原核表达蛋白，进行纯化后测定蛋白的浓度（BSA法测定）。
4 ℃保存。
注：提取的植物总蛋白（贝博试剂盒）进行EMSA实验，蛋白易滞留在点样孔，具体原因尚不明确。
2.探针：合成biotin标记的探针、未标记的探针、突变探针（需要HPLC纯化）。
注：合成单链探针，使用时1:1混合，利用PCR仪合成双链探针。
具体步骤：探针根据使用浓度用DEPC水稀释，正链：反链 = 1:1 ,PCR程序：75 ℃30 min，以后每个循环降低0.1 ℃，直到0 ℃。
3.6 % EMSA非变性胶：制胶前需要把制胶模具清洗干净，不能有SDS残留。
一块胶的用量（6 mL），不用制浓缩胶。
5 × TBE 1 mL30 % acrylamide/bisacrylamide 2 mL40 % 甘油 625 μLO 3.125 mLdd H210 % 过硫酸铵 150μLTEMED 5 Μl4.EMSA结合反应：（20 µl反应体系，蛋白和探针根据实验需求和预实验进行调整）阴性对照反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl标记好的探针样品反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子标记好的探针探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的探针标记好的探针突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的突变探针标记好的探针Super-shift反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子目的蛋白特异抗体标记好的探针在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
凝胶迁移实验(EMSA)看这篇就够了!
凝胶迁移实验（EMSA）看这篇就够了！概念EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测，是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
原理EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。
分类同位素标记探针特点：特异性强、敏感性高达到10-18mol水平，对操作人员身体有害非同位素标记探针------应用最为广泛特点：无需放射显影，采用生物发光或化学发光原理。
灵敏度高，信号强EMSA的特异性常用实验技术中免疫组化、免疫印迹 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于转录因子检测，但三者的侧重点各有不同。
免疫组化或免疫荧光技术可以较准确的反应转录因子的表达部位和表达细胞， Western Blotting 可以精确定量转录因子。
但并非所有转录因子均可以与 DNA 结合以刺激基因转录，唯有EMSA 技术可以反映转录因子是否具有 DNA 结合活性，故 EMSA 是证明细胞信号转导通路最终效应的必要实验技术。
实验步骤（步骤来源与网络仅供参考）探针的标记①:探针标记的反应体系(1.75pmol/μl) 2μlT4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μlNuclease-Free Water 5μl[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μlT4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl总体积10μl②:使用水浴或PCR仪37℃反应10min.③:加一定体积的终止液、混匀、终止探针标记.④:加入一定体积的TE、混匀.探针的纯化(视情况定）对于100μl标记好的探针，加入一定量的醋酸铵和无水乙醇在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀过夜在4℃12000g-16000g 离心30min 弃上清在4℃12000g-16000g 离心1min、吸去残余液体加入一定体积的 TE ,使沉淀溶解探针使用时间一般不超过3天，保存在-20℃实验中常见的问题：1、为什么看不到迁移带？1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
EMSA实验..
3、制备凝胶，电泳 （1） 必须是非变性PAGE凝胶,一般用6.5%的非变性胶.制胶 很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果。
10XTBE 40%Acrylamide(聚丙烯酰氨) 1.0ml 3.3ml
deionized,sterilewater
50%Glycerol（甘油） TEMED（四甲基乙二胺） 脱气10min 10%AP （过硫酸铵）
3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探 针？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白， 部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化： 一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA 的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核 抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。 部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应 保存在-20℃以防止降解。 无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融！
5、紫外交联
紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统主要用于将
核酸交为使核苷酸固定在杂交膜上。传统的方法是将膜置于80℃ 真空烘箱中烘2小时，在本紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照
射几秒钟即可。
· 紫外照射可使杂交信号比
传统烘烤法提高5-10倍。
5.洗涤、孵育
用Washing Buffer洗涤(整个 过程避免膜干燥) 倒掉冲洗缓冲液，加入Block Buffer轻微震荡20min
加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素 室温震荡孵育45min。（勿将酶标记 物直接加到膜上）
去掉酶联物稀释液，用Washing Buffer洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。 配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。 （可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上， 使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
EMSA技术的原理
EMSA技术的原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）技术是一种常用的生物学实验方法，用于研究蛋白质与核酸相互作用的原理。
该技术可以测定核酸结合蛋白的结合亲和性和特异性。
下面将详细介绍EMSA技术的原理。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异。
在该实验中，核酸分子（DNA或RNA）与特定的蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和检测来观察和分析。
EMSA技术的主要步骤包括以下几个方面：第一步是制备探针。
通常使用核酸探针来进行EMSA实验。
探针可以是标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA分子。
这些探针通常具有与目标蛋白质结合的特定序列。
第二步是制备样品。
样品通常包括目标蛋白质和核酸探针。
目标蛋白质可以是从细胞提取的总蛋白质，也可以是经过纯化的特定蛋白质。
核酸探针和目标蛋白质在适当的缓冲液中混合，形成复合物。
第三步是电泳分离。
样品中的复合物和未结合的核酸探针通过电泳在聚丙烯酰胺凝胶中分离。
由于复合物的存在，复合物的电泳迁移速度较慢，而未结合的核酸探针的电泳迁移速度较快。
第四步是转移和固定。
在电泳分离之后，核酸分子被转移到固定在膜上的凝胶上。
这一步可以通过将凝胶与膜进行转移来完成。
第五步是探针的探测。
转移后的凝胶上的核酸探针可以使用适当的方法进行探测。
常用的方法包括荧光染色、放射性探测和化学发光等。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异，通过核酸探针与目标蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和探测来观察和分析。
EMSA技术在研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用、转录调控、信号传导等方面具有广泛的应用。
它可以帮助科学家们更好地理解生物学过程以及相关疾病的发生机制，为新药的开发和治疗提供有力的依据。
EMSA原理简介
EMSA原理简介
EMSA（Expectation-Maximization Sequence Analysis）是一种基于序列分析的统计
方法，主要用于序列分类、序列比对、序列结构预测等领域。
该方法采用统计模型来描述
序列相似性和差异性，并通过最大似然估计来推断模型参数，从而实现序列处理。
EMSA方法常常用于生物领域中的DNA序列分析、RNA序列翻译、蛋白序列比对等方面。
EMSA方法的核心思想是通过期望最大化算法来寻找序列中隐藏的模式和信息。
这种方法最初是由Baum-Welch在20世纪70年代提出的，用于寻找隐马尔科夫模型中的参数估计。
随着计算机技术的飞速发展，EMSA方法被广泛应用于序列分析领域中，成为序列分析的一种有效工具。
EMSA方法主要分为两步。
第一步是期望步骤（Expectation），根据当前模型参数下的序列数据，计算对应的期望值；第二步是最大化步骤（Maximization），根据期望值更新
模型参数，使得目标函数达到最大化。
这样交替进行期望步骤和最大化步骤，直到目标函
数收敛。
EMSA方法另一优点是能够处理缺失数据或不完整的数据，且不需要知道先验信息，因此更加灵活。
EMSA方法在序列分析中的应用非常广泛，例如DNA序列分析中的基因预测、蛋白质序列分析中的结构预测、RNA序列翻译中的密码子优化等。
其中，EMSA可以有效检测DNA中
的启动子、剪接位点、保守序列以及基因组重排等特征，并在蛋白质序列比对中发挥重要
作用。
在RNA序列翻译方面，EMSA可以优化编码基因中的密码子使用频率，提高蛋白质翻译效率。
emsa名词解释
emsa名词解释EMSA是一种常见的生化实验技术，全称为“Electrophoretic mobility shift assay”，俗称为“凝胶迁移实验”。
在这种实验中，我们可以通过观察RNA结构的变化，确认某些生物分子是否发生了结合反应。
具体来说，EMSA实验采用聚丙烯酰胺凝胶，将待检测样品和某种探针分子混合在一起，然后通过电泳的方法将其分离开来。
在不同的条件下，通过观察聚丙烯酰胺凝胶上的条带位置和强度，可以推断出反应的程度和反应物的性质。
下面，我们来分步骤地详细解释一下EMSA实验的具体流程，以及相关术语的解释：一、制备RNA首先，需要用RNA质量较好的样品生成RNA，以便进一步的实验。
或者可以从商业供应商购买RNA。
可以通过几种方法从生物体中提取RNA。
RNA可以用酚/氯仿（Trizol）或离心管柱提取法制备。
二、制备探针分子对于探针分子而言，常常是一个小片段的DNA、RNA，其含有被研究物质特异性结合位点。
对于DNA，可以用化学合成，PCR扩增等方法制备。
三、制备样品制备可能与反应结合的样品。
该样品可以是纯化的蛋白质，也可以是某些细胞内营养物质。
四、制作凝胶制作聚丙烯酰胺凝胶。
五、混合样品与探针分子将RNA混合在一起并进行反应。
六、电泳将反应混合物分别放入凝胶槽中，在电在下放置定向器，使得带电颗粒沿电场方向迁移。
七、凝胶染色将染色溶液加入聚丙烯酰胺凝胶中，染色使得看得到兴趣的区域。
EMSA实验因其操作简单、敏感性好的特点而广泛应用于生物、医学等领域，比如针对病毒、药物的临床研究。
同时，也是重要的免疫诊断和药物筛选的实验之一。
EMSA原理和方法
EMSA原理和方法EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移位移分析）是一种常用的分析DNA结合蛋白与DNA结合的技术。
它可以通过观察DNA是否与蛋白结合来研究蛋白与DNA的相互作用。
EMSA方法具有操作简便、成本低廉、结果可靠等优点，因此被广泛应用于生物医学、遗传学以及分子生物学等领域。
EMSA基于DNA与蛋白质所生成的复合物的电泳迁移速度与DNA的游离状态不同的原理。
DNA与蛋白质结合后形成的复合物较大，迁移速度较慢，而游离状态的DNA则迁移速度较快。
通过将待测的DNA与蛋白反应，将形成的DNA-蛋白复合物与游离状态的DNA物理上分离，然后经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，进一步观察蛋白与DNA结合的结果。
EMSA方法步骤：1.准备工作：制备DNA探针和蛋白样品。
DNA探针可以是标记有放射性核素或融合具有染色剂/荧光信号的探针。
蛋白样品可以是纯化的蛋白或细胞提取物等。
2.反应：将DNA探针与蛋白样品一起孵育，使其发生结合反应。
孵育条件可以根据实验需要进行调节，如温度、时间和缓冲液组分等。
3.分离：将反应体系进行电泳分离。
一般来说，使用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质，并在缓冲液中加入电解质以产生电场。
根据DNA与蛋白复合物的大小不同，可以调整电泳条件以实现适当的分辨率。
4.可视化：根据标记方式的不同，可以采用相应的方法进行检测。
对于放射性标记的DNA探针，可以使用放射自显影或闪烁计数方法来观察。
而对于使用染料或荧光标记的DNA探针，则可以使用紫外线照射或荧光成像等方式进行可视化。
EMSA应用：1.鉴定和验证DNA-蛋白相互作用：通过EMSA可以迅速判断DNA与特定蛋白是否发生结合，从而推断该蛋白是否与一些基因或DNA序列相关联。
2.研究DNA结合蛋白的特性：EMSA可以帮助研究DNA结合蛋白的亲和性、特异性以及结合位点等特性。
3.研究信号转导通路：EMSA可以用于检测信号转导通路中的激活因子与DNA的结合情况，从而了解这些激活因子在信号转导过程中的作用。
EMSA操作步骤
EMSA操作步骤EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移转移实验）是一种常用的生物技术方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
EMSA可以在体外检测和分析DNA结合蛋白质的形成复合物。
下面是EMSA的基本操作步骤。
1.DNA探针制备首先，需要根据研究目标设计和合成DNA探针。
DNA探针是由与目标蛋白质结合的DNA序列组成的DNA片段。
这个DNA片段可以从已知的基因组DNA中扩增，或者使用人工合成的DNA序列。
2.DNA探针标记将DNA探针标记上荧光或放射性同位素等标记物，以便在电泳中进行检测和定量。
常用的标记方法包括使用荧光染料标记或使用放射性核素标记。
标记DNA需要进行纯化和测定其浓度。
3.蛋白质提取从感兴趣的组织或细胞中提取蛋白质。
常用的方法包括细胞溶解、裂解、超声波溶解等，使用络合剂、蛋白酶抑制剂和还原剂等添加剂来保护蛋白质免受降解。
4.蛋白质净化通过离心、过滤、洗涤等方法获得纯化的蛋白质。
纯化过程中，也需要添加一些保护蛋白质的添加剂。
5.EMSA实验条件优化对EMSA反应条件进行优化，以获得最佳结果。
例如，调节反应的pH 值、离子浓度、反应温度、反应时间等。
6.反应体系制备将合适的缓冲液、DNA探针、蛋白质溶液和其他必要的添加剂混合在一起，形成EMSA反应体系。
通常，反应体系中还需要添加一些非特异性竞争性DNA片段，以确保特异性结合。
7.EMSA实验进行将EMSA反应体系加载到预先制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，进行电泳分离。
电泳过程中，DNA片段会被蛋白质结合形成DNA-蛋白质复合物。
较大的复合物会迁移较慢，而较小的自由DNA片段会迁移较快。
8.凝胶电泳分析将电泳板取出，进行染色或检测DNA探针的标记物，以可视化复合物和自由DNA片段。
常用的染色方法包括乙酰亚胺染色、溴化乙锭染色等。
另外，也可以使用荧光成像系统、放射性成像系统等仪器进行检测和定量。
EMSA原理流程
EMSA原理流程EMSA（Electrophoretic mobility shift assay，电泳迁移位移实验）是一种检测蛋白质与核酸结合的技术，最早由Gel supershift assay发展而来，广泛应用于研究转录因子与DNA、RNA结合的相互作用。
EMSA的原理流程可概括为以下几个步骤：1.准备核酸探针：首先从目标基因或细胞中提取出DNA或RNA序列作为核酸探针。
可以通过DNA合成或RT-PCR等方法获得探针。
3.蛋白质提取：从细胞中提取目标蛋白质。
可以通过细胞裂解、超声波破碎等方法获得细胞提取液。
4.建立结合反应：在核酸探针中加入蛋白提取物，允许蛋白与核酸进行结合反应。
探针中应含有识别蛋白的特定结合位点，以便蛋白与核酸发生特异性结合。
5.蛋白质-核酸复合物分析：将反应体系经过电泳分离，使得蛋白质-核酸复合物与未结合的核酸探针分开。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
6.转移至固相载体：将电泳分离后的核酸转移到固相载体上（例如膜或纸片），并通过热固定或化学固定的方法固定上载体。
7.检测：使用相应的探针进行检测，检测的方法根据标记的种类选择不同。
放射性标记可以通过放射自显影方法进行直接可视化，非放射性标记则需要使用化学染色、荧光分析或荧光成像仪等。
EMSA的实验结果可根据以下几个特点进行解析：1.非特异性结合：如果存在非特异性结合，会出现不同大小的带状物，这些物质可能是一些非特异性结合蛋白或其他污染物质。
2.特异性结合：如果目标蛋白与核酸发生特异性结合，会形成一条或多条移动缓慢的带状物，代表着蛋白与核酸形成的复合物。
3.超迁移：当反应体系中存在过量的蛋白质时，可能会出现超迁移现象，即核酸复合物迁移得更快，并在背景中形成迁移较快的带状物。
4.超迁移抑制：一些条件下，蛋白质可能影响核酸的迁移速度，使得带状物迁移更慢或完全停滞。
这种现象通常被称为超迁移抑制。
EMSA是一种敏感和简单的技术，广泛应用于研究转录因子与DNA或RNA结合的相互作用。
emsa竞争探针原理(一)
emsa竞争探针原理(一)EMSA竞争探针原理简介在生物学研究中，电泳迁移速度差异分析是一种常用的手段。
EMSA（Electrophoretic mobility shift assay，电泳迁移速度差异分析）是一种通过电泳分离并分析DNA中的蛋白结合位点的技术。
本文将从浅入深地解释EMSA竞争探针的原理。
EMSA的基本原理EMSA利用电泳迁移速度差异来检测DNA与蛋白质的结合情况。
首先，将待测DNA与蛋白质一起孵育，形成DNA-protein复合物；然后，将该复合物与未结合的DNA片段进行电泳分离；最后，通过观察DNA片段在凝胶上的位置变化，判断蛋白与DNA结合的程度。
EMSA竞争探针原理概述EMSA竞争探针原理是通过引入竞争性DNA片段来评估DNA和蛋白质复合物的亲和力。
该竞争探针与待测DNA相似，可以与蛋白质竞争结合，从而减少DNA-protein复合物的形成。
通过对不同浓度的竞争探针进行电泳分离，我们可以推断出待测DNA与蛋白质的结合能力。
详细原理1.首先，设定一组不同浓度的竞争探针。
2.将每种浓度的竞争探针与待测DNA和蛋白质一起孵育，形成DNA-protein复合物。
3.然后，将这些复合物与未结合的DNA片段进行电泳分离。
4.通过观察DNA片段的迁移位置，我们可以发现一种浓度的竞争探针，使得复合物的形成最显著减少。
5.找到这种竞争探针的浓度，可以推断出待测DNA与蛋白质的结合能力。
结论EMSA竞争探针原理是一种通过引入竞争性DNA片段来评估DNA-protein复合物亲和力的方法。
通过电泳分离和观察DNA片段的迁移位置，我们可以推断出待测DNA与蛋白质的结合能力。
这种原理在生物学研究中具有广泛的应用，可用于研究DNA结合蛋白的功能和相互作用机制。
通过深入了解EMSA竞争探针原理，我们可以更好地理解和应用这一技术。
emsa凝胶迁移实验原理
emsa凝胶迁移实验原理什么是emsa凝胶迁移实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常见的核酸-蛋白质相互作用研究技术。
它通过利用蛋白质与核酸结合形成复合物的特性，在电场下进行凝胶电泳迁移，从而分析和鉴定核酸与蛋白质之间的相互作用。
这个过程的实质是先将核酸与蛋白质按照一定比例混合反应，形成核酸-蛋白质复合物，然后将这个复合物与未结合的核酸分子一起进行凝胶电泳。
核酸-蛋白质复合物迁移速度较慢，而游离核酸迁移速度较快，因此可以通过观察凝胶中的带状图案来判断核酸与蛋白质是否发生相互作用。
EMSA凝胶迁移实验原理包括以下几个关键步骤：1. 核酸与蛋白质的结合：首先，需要获得待检测蛋白质所特异结合的核酸序列。
这个核酸序列可以是DNA、RNA或核酸伸展结构。
然后，将核酸与蛋白质按照一定比例混合，在适当的反应条件下进行结合。
常用的反应条件包括缓冲液pH值、离子浓度、温度等。
2. 核酸-蛋白质复合物的分离：混合物中的核酸-蛋白质复合物通常比未结合的核酸分子具有较大的分子量，迁移速度较慢。
因此，可以通过凝胶电泳来将复合物与游离的核酸分子分离开来。
常用的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
3. 凝胶迁移：将经蛋白质和核酸反应后的混合物加载到凝胶中，然后通过应用电场使核酸与蛋白质复合物迁移。
电场的作用是带动带电的分子在凝胶中移动，移动速度与其电荷量和形状有关。
4. 分析结果：通过凝胶电泳的分离，可以得到带状图案。
观察不同带状图案的位置、强度和大小可以判断蛋白质与核酸的结合情况。
当蛋白质与核酸发生结合时，形成的复合物迁移速度较慢，带状图案位置上移或移动较慢；反之，当蛋白质与核酸未结合时，带状图案位置下移或迁移速度较快。
需要注意的是，EMSA凝胶迁移实验只能证明核酸与蛋白质之间是否存在相互作用，无法提供相互作用的具体结合位点信息。
因此，为了进一步研究相互作用的机制，通常需要结合其他技术手段，如DNase I酶切、ChIP-Seq等。
EMSA实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）即电泳迁移位移实验，是一种常用的蛋白质-DNA结合实验方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
此方法可以定量地测定蛋白质与DNA的结合能力、结合亲和力以及结合位点等信息。
EMSA实验原理基于电泳的特性以及蛋白质与DNA相互作用的原理。
其中，电泳是一种利用带电粒子在电场中的迁移速度差异进行分离的技术。
而蛋白质与DNA相互作用是一种高度特异性的细胞调控机制，可以通过特定的结合位点进行互相作用。
EMSA实验中，首先需要准备DNA探针和蛋白质样品。
DNA探针通常是通过合成或者酶切等方法得到的特定序列的DNA片段，可以是自然基因的启动子区域、刺激响应元件等。
蛋白质样品可以是从细胞提取的总蛋白质、纯化的重组蛋白质等。
接下来，将DNA探针与蛋白质样品按照一定比例混合，使其结合形成复合物。
复合物形成后，加入一定量的缓冲液和电泳缓冲染料。
然后将上述混合物加载到凝胶孔中，通过电泳进行分离。
在电泳过程中，由于复合物形成后的DNA探针变得较大、带电量增加，迁移速度减慢。
相对应的，没有与蛋白质结合的自由DNA探针迁移速度较快。
于是，在电泳完成后，可以通过染料或放射性示踪剂观察凝胶上的蛋白-DNA复合物和自由DNA探针，从而确定蛋白质与DNA相互作用的存在与否以及结合强度。
根据EMSA的结果，可以得到蛋白质与DNA结合的信息。
通常，EMSA的定性结果是通过观察是否存在凝胶上的复合物带来判断的。
如果存在复合物则表明蛋白质与DNA结合，没有复合物则表明蛋白质没有与DNA结合。
EMSA的定量结果可以通过比较复合物带与自由DNA带的强度来判断蛋白质与DNA结合强度的大小。
一般来说，复合物带的强度越高，表示蛋白质与DNA的结合能力越强。
此外，EMSA还可以通过引入竞争实验来确定蛋白质与DNA结合的位点。
在竞争实验中，除了DNA探针外，还加入具有相同结合序列的竞争DNA。
EMSA
实验概要凝胶迁移或电泳迁移率实验是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和标记的DNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，粗蛋白或核细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡核营酸片段(特异)和其它非相关的片段(非特异)来确定DNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
实验步骤1. 探针的标记探针为含有与蛋白特异结合的中心盒，大约20 bp左右，使用pierce 公司的3’末端标记试剂盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)标记。
操作步骤参照说明书，具体步骤如下：1) 将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。
迅速稀释TdT：Sx TdT Reaction Buffer 2 u1，超纯水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。
稀释后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul)，稀释后的TdT必须现配现用，稀释后不能保存。
2) 反应体系：5x TdT buffer 10 ul，DNA 5 pmol，Biotin-ll-UTP 5 ul，diluted TdT5 ul，超纯水补足50 ul。
在37℃温浴3 0 min，加入2/5体积0.2 M EDTA，终止反应。
加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提TdT，涡悬充分，高速离心3 min，取上层即为标记探针，分装后-80℃保存。
2. 非变性电泳1) 非变性电泳：30%丙稀酸胺2.66 ml，TBE(5X)2 ml，10%过硫酸按1.4 ml，TEMED7 ul，双蒸水补足20 ml。
按照上述配方配置4%的非变性胶。
EMSA
3
制备非变性聚丙烯酰胺凝胶
EMSA中使用的非变性聚丙烯酰胺凝胶
浓度通常为4%-5%。制胶过程如下： （1）在一容器中，加入30%丙烯酰胺-N,N’-亚甲双丙烯酰胺 溶 液 6.7ml,5xTBE 5ml,10% 过 硫 酸 铵 500μ l ， TEMED 50μ l, 加双蒸水补足至50ml，混匀后立刻灌胶，尽量避免产生气泡。 （2）小心插入梳子，待胶凝固。凝固后如不即使用，可将 胶打湿并用保鲜膜包裹后于4 ℃放置备用。
2 提取细胞核蛋白 （1）细胞经一定条件处理后，针对贴壁细胞，直接弃培 养液，用pbs冲洗细胞后，加入适量含pmsf的pbs，用细胞 刮子刮取细胞 （2）在4℃，1500r/min离心十分钟，弃上清，加入1ml缓 冲液A，冰浴十分钟，然后用匀浆器匀浆。 （3）在4℃，2500r/min离心5min，沉淀用缓冲液 A100μ l 洗涤后，再用缓冲液B40μ l重悬，冰浴20min，期间涡旋 振荡数次。 （4）在4℃，14000-16000g离心10min，将上清移至新ep 管中，加入等体积缓冲液c。测定蛋白浓度后，分装-70 ℃保存备用
（电泳时间通常为2-3h）。
5 检测： 1）停止电泳后，小心取下胶板。打开其中一块， 使凝胶贴于另一胶板，随后用与凝胶大小一致的 滤纸从胶的一侧逐渐覆盖整个凝胶，轻轻把滤纸 压紧，继而把凝胶转移到滤纸上。 2）把滤纸测向下放平，在胶的上面覆盖一层保鲜 膜，在干胶机上80 ℃干胶1-2h。 3)将干胶定于曝光盒中，在暗室中将x胶片放入固 定有干胶的曝光盒中，于-20-80℃曝光 4）取出胶片进行显影和定影处理，然后结果分析
4 预电泳和电泳
（1）预电泳：拔除梳子对各孔进行冲洗后，接通电源，
在100-150v进行预电泳30min以上。 （2）电泳： 1）将各反应样品分别加到聚丙烯酰胺凝胶的不同孔中， 将有溴酚蓝的上样缓冲液单独上样于1孔中作为电泳迁移 标志。 2）在0.5xTBE缓冲液中电泳，电压100-150v，针对长为 20cm的胶，直至溴酚蓝迁移至距胶板下缘1/4-1/3处为止
EMSA原理和方法
EMSA原理和方法EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于分析蛋白质与核酸之间的相互作用。
该方法基于蛋白质-核酸结合能够改变DNA的电泳迁移性质这一原理，可以用来研究包括转录因子结合DNA、蛋白质与RNA结合等各种生物过程。
EMSA的方法主要包括以下步骤：1.核酸样品制备：首先需要设计合适的寡核苷酸序列，可以是靶基因的DNA片段，也可以是其中一个DNA串联序列。
核酸样品需要标记辐射或荧光，常用的方法是使用γ-32P对DNA进行标记。
可以通过PCR扩增或化学合成的方法获得核酸样品。
2.蛋白质样品制备：需要提取蛋白质样品，一般通过细胞裂解、离心和蛋白质抽提等步骤来获得。
此外，还需要对蛋白质进行纯化和浓缩。
3.执行EMSA：首先在核酸样品中加入可以竞争结合的非标记的核酸片段，这样可以减少非特异性结合。
然后将标记的核酸样品与蛋白质样品混合，充分反应。
可以根据需要加入竞争物质，如自由核酸片段或抗体等。
最后，将样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据核酸与蛋白质结合后的电荷和大小的差异，观察蛋白质-核酸结合物和游离核酸在凝胶上的迁移性质。
4.凝胶分析：通过将电泳后的凝胶放射在放射敏感的薄膜上，或者直接使用荧光成像系统观察和记录核酸的位置和相对强度。
可以通过比较不同处理组的凝胶图像，分析蛋白质与核酸结合的结果。
EMSA结果可以根据核酸带的强度和迁移性质来判断蛋白质与核酸的结合情况。
EMSA除了可以用于定性分析蛋白质和核酸的结合情况外，还可以进行定量分析。
通过构建核酸浓度标准曲线，可以用来测定未知样品中特定核酸与蛋白质的结合亲和力和亲和常数。
EMSA是一种简单且常用的技术，在分子生物学和基因调控研究中得到了广泛应用。
它可以帮助研究人员解析转录因子与DNA结合和蛋白质与RNA结合等生物学过程，从而深入了解基因调控和信号转导等机制。
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二、NF-kB的凝胶电泳迁移率改变试验方法（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）：
（一）γ-32P标记同序寡核苷酸（磷酸化反应）
1、在一个高压灭菌的0.2mlEP管中，加入下列成份：
NF-kB同序寡核苷酸（1.75pmol/μl）2μl
T4 polynucleotide kinase (T4多核苷酸激酶) 10×Buffer 1μl
[γ-32P]ATP (3000Ci/mmol at 10 mCi/ml) 1μl
Nuclease-Free Water （去核酸酶水）5μl
T4 polynucleotide kinase (T4多核苷酸激酶) （10u/μl）1μl
总体积10μl
2、37℃孵育10分钟
3、加入1μl的0.5M EDTA终止反应
4、加入89μl TE buffer, 至此，标记的同序寡核苷酸探针制备完成。
（二）凝胶迁移试验
A．4%非变性聚丙烯胺凝胶的制备。
在干净的三角烧瓶中加入：
TBE 10×buffer 1ml
37.5:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,W/V) 1.25ml
40% acrylamide (W/V) 0.75ml
80% glycerol （甘油）625μl
双蒸水16.2ml
TEMED 10μl
10% APS （过硫酸胺）150μl
总体积20ml
B．DNA结合反应
1、在四个高压灭菌的0.2ml EP管中，依次配置下述两个反应：
反应1：（目的反应）
5μl 去核酸酶水
2μl Gel Shift Binding 5×Buffer
2μl 核蛋白抽提物
9μl 总体积
反应2：（特异性竞争试验）
4μl 去核酸酶水
2μl Gel Shift Binding 5×Buffer
2μl 核蛋白抽提物
1μl 未标记的同序寡核苷酸（NF-kB）
9μl 总体积
2、在室温下孵育10分钟，然后各加入1μlγ-32P标记的NF-kB同序寡核苷酸（终浓度为未标记的同序寡核苷酸浓度的1%）至上述每个反应体系中。
3、室温下孵育20分钟。
4、各加入1μl室温10×加样缓冲液（gel loading 10×buffer）
C．DNA-蛋白复合物电泳（4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）：
1、在加样之前，将制好的4%凝胶在0.5×TBE Buffer中，以350V预电泳1小时。
加样之后，在室温下，0.5×TBE中，以350V电泳，直至溴酚兰至3/4处。
2、打开凝胶玻璃板，把凝胶放在Whatman 3MM滤纸上，盖上塑料板，干胶机干胶，置X光片夹中，并放入X光片，夹好，予-70℃冰箱一定时间后取出暴光，显影，定影，扫描，照片，分析。