生物工程大实验报告

生物工程大实验

30L发酵罐上黄原胶发酵实验

姓名：

学号：

学院：生命学院

专业：生物工程

年级：

同组成员：

1.材料和方法

1.1菌株：HYJ

1.2培养基

1.2.1斜面培养基（100ml）

葡萄糖 3.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.3；

氯化钠0.5；琼脂 2.0；pH 7.0-7.3

灭菌条件：115℃，20min；培养温度：30℃；培养时间：24-48 h

1.2.2种子培养基（100ml）

葡萄糖 2.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.1；

牛肉膏0.3 g；pH 7.0-7.3

灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：10-15 h

1.2.3发酵培养基（100ml）

葡萄糖 3.0；蛋白胨0.2；酵母粉0.1；Na2HPO4·12H2O 0.252；KH2PO4 0.3；

K2SO4 0.1；MgSO4·7H2O 0.1；pH 7.0-7.3

灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：48-62 h

1.3. 培养条件

1.3.1斜面培养

1）配置400 ml的斜面培养基，分装试管，于115℃下灭菌20 min，之后摆斜面，冷却至室温后，将凝固后的斜面放于30℃培养箱过夜。

2）转接斜面菌种，将转接好的斜面菌放于30℃培养箱培养24-48 h。

1.3.2一级种子培养

1）配置种子培养基：按照种子培养基配方配制3000 ml，分别分装到5000 ml 和500 ml的三角瓶中，装液量分别为100 ml/500 ml三角瓶（用于一级种子培养）；1000 ml/5000 ml三角瓶（用于二级种子培养），于115℃下灭菌20 min。

2）接种：将培养好的斜面菌种接种到一级种子培养基中（100 ml/500 ml三角瓶），

接种量为每瓶2-3接种环，放在30℃摇床培养10-15 h，转速为200 rpm。

1.3.3二级种子培养

将培养好的一级种子接种到二级种子培养基中（1000 ml/5000 ml三角瓶），接种量为10%（v/v），放在30℃摇床培养6-8 h，转速为200 rpm。

1.3.4发酵罐培养

1）配置发酵培养基20 L，考虑到接入的种子液的体积（10%, 2000 ml），所以培养基配置定容时为18 L。

2）将培养好的二级种子接种到发酵罐中，接种量为10%（v/v），温度30℃，发酵罐初始搅拌转速约为100 rpm，通风量1.5-2.0 vvm，初始pH为7.0-7.3，中间过程不控制pH。

1.4 检测方法

1.4.1发酵液OD

取一定体积的发酵液进行适当稀释，然后用分光光度计在620 nm波长下测定吸光度。

1.4.2葡萄糖含量

取一定发酵液进行适当稀释，8000 rpm/min 离心15 min，取上清，采用SBA 检测。

1.4.3发酵液粘度

发酵过程中取大约100 ml发酵液，用Blankspoon粘度计(DV-E，VISCOMETER)测定其粘度。

1.4.4黄原胶产量测定

发酵结束后取10 ml发酵液，用3倍体积无水乙醇沉淀黄原胶，8000 rpm/min 离心15 min，去上清，沉淀的黄原胶50℃通风箱内干燥至恒重，用分析天平称重。

1.4.5 pH值测定

用pH计测定发酵液的pH值。

1.4.6菌体干重的测定

取发酵液10 ml加入20 ml去离子水稀释，放置在80℃水浴锅中用1 mol/l NaOH调节pH10后，水浴15 min，然后再用1 mol/l HCl调节pH7.0，迅速12000 rpm离心20 min，去上清，留沉淀，于50℃通风箱内干燥至恒重（8-10 h）。

1.4.7计划取样时间及待测参数：

前24 h发酵过程中，每隔4 h取一次样测定pH、发酵液OD、黄源胶产量、菌体干重，葡萄糖含量、发酵液粘度。

2. 结果与讨论

2.1实验图片

其中A为斜面上菌的镜检图B为二级种子镜检图C为28.5h镜检图D为70h镜检图

2.2 30L发酵罐上的发酵曲线

a)发酵曲线汇总

b)菌干重

上图为菌干重数据以及拟合曲线（OD实际也是反映菌体浓度，因此在此不做讨论），可以看出实际的数据与拟合曲线拟合的并不是很好。而且我们由于接种量比较大，为15%的接种量，且经过二级种子的培养也没有延迟期，故最大生长速率应该在20h左右，但由于发酵液后期产胶过大，粘度过大，而我们分离菌的方法比较简单原始，故后期很难将菌从发酵液中分离下来，故后期所测的菌的干重实际是菌和部分胶的重量，后期数据不准因而导致实验结果误差较大。

c)胶干重曲线

其中A为原始数据作图，B为删掉0小时数据作图

在0h我们取样时可能未等发酵液混匀后便取，因而测得的胶干重数据异常，可以看出A图数据拟合的并不是很好，在B图中我将0h胶干重设为0，可以看出拟合度大大提高。从数据来看，胶干重测量还是不错的，当然由于提取胶的方法比较简单，会有部分菌带到胶中，这也是不可避免的误差。可以看出在15小时左右时胶的产生速率最大，而到30小时左右时胶的产生速率有所下降并在逐渐降低，这与底物的消耗、溶氧的降低等因素有关。

d)残糖曲线

从图中可以看出所测的数据与拟合直线拟合的较好，这证明实际的操作比较规范。从一开始糖的消耗来看，消耗量较小，原因可能是菌种有延迟期；但从8h开始，糖的消耗量迅速增加，到30h左右残糖量已经到了一个较低的值，这证明在这段时间内菌体大量繁殖消耗了糖分。到发酵后期，发酵液中溶氧量和菌对糖的消耗量处在一个很低的水平，此时菌体进入衰退期。e)溶氧曲线