HPLC法测定贵州地产重楼中六种重楼皂苷的含量

HPLC法测定贵州地产重楼中六种重楼皂苷的含量
目的通过对贵州地产重楼中6种重楼皂苷的含量，为贵州地产重楼的质量控制提供依据，促进重楼的进一步开发和利用。

方法Agilent TC-Cl8（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：0→30min，乙腈（33→65）：水（67→35）；30→35min，乙腈（65→33）：水（35→67）；流速1.0mL/min，測波长为203nm。

结果贵州地重楼中6种重楼皂苷的标准曲线线性良好（r>0.9999），回收率均在99.73%～100.08%，RSD<1.0%。

结论该方法准确、可靠，可用于贵州地产重楼中6种重楼皂苷的含量分析。

标签：HPLC；重楼；重楼皂苷；质量测定
重楼是一味传统民族药，为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var。

chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎[1]。

全世界共有26种，我国有20种，主要分布在我国云南、四川、贵州等地带[2]。

具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效，其主要活性成分是甾体皂苷，约占总化合物数目的80%，具有很好的抗肿瘤、免疫调节等作用[3-5]。

重楼的主要有效成分是甾体皂苷、脂肪酸脂、甾醇等，其中甾体皂苷是主要活性成分。

常见的测定方法有HPLC法、比色法、及分光光度法法等。

1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括低压四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、ChemStation色谱工作站；METTLERAE240型电子天平（德国梅特勒.托利多公司）；重楼对照药材（批号121157-201003）、重楼皂苷I（批号111590-201103）、重楼皂苷Ⅱ（批号111591-201103）、重楼皂苷Ⅵ（批号111592-201402）、重楼皂苷Ⅶ（批号111593-201402），对照品均购自中国食品药品检定研究院，重楼皂苷Ⅴ（批号201002）、重楼皂苷H、（批号201003）上海同田生物技术股份有限公司，重楼药材采于贵州山区。

乙腈（德国Merck）色谱纯，水超纯水。

2 方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验色谱柱：AgilentTC-Cl8柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0→30min，乙腈（33→65）：水（67→35）；30→35min，乙腈（65→33）：水（35→67）；流速1.0mL/min，测波长为203nm。

重楼皂苷I峰理论板数14177。

色谱图见图1。

图1 重楼皂苷混合对照品和样品的HPLC 色谱图
2.2对照品溶液的制备取重楼皂苷I对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅵ对照品、重楼皂苷Ⅴ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品及重楼皂苷H对照品适量，
精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备取本品粉末约5g，精密称定，加入乙醇100mL，加热回流3h，过滤，滤液回收乙醇，浸膏加乙醇醇沉24h，过滤，滤液回收溶剂后减压蒸干，精密加入甲醇100mL后称定重量，超声40min，放冷，再称重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得。

2.4线性范围分别精密吸取混合对照品溶液2，5，10，20，40μl注入高效液相色谱仪。

以进样量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线，重楼皂苷I、I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ、H线性回归方程分别为Y=1.7635X-0.0574（r=1）、Y=1.7881X-0.2171（r=0.9999）、Y=1.7853X-0.073（r=0.9999）、Y=1.782X+0.0379（r=0.9999）、Y=1.7742X+0.4968（r=0.9999）、Y=1.7762X+035467（r=0.9999）。

表明在各自的线性范围内，6种皂苷的进样量与峰面积值之间呈良好的线性关系。

见图2。

图2 重楼皂苷混合对照品的标准曲线图
2.5精密度试验取对照品溶液进样10μl，连续进样6次，记录峰面积。

结果重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ、H的RSD分别为0.98%、0.97%、0.84%、0.36%、0.92%、0.77%、（n=6），表明仪器性能良好。

2.6回收率试验取重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ、H含量分别为2.23%、2.98%、0.89%、0.75%、1.32%、0.98%的重楼粉末6份，每份约5g，精密称定，按”2.4.3项”方法制备。

精密量取1mL分别精密加入重楼皂苷I（5.58mg/mL）、Ⅱ（7.45mg/mL）、Ⅵ（2.23mg/mL）、Ⅴ（1.88mg/mL）、Ⅶ（
3.30mg/mL）、H （2.45mg/mL）对照品溶液0.2mL，混合均匀。

取混合溶液进样10μl，注入高效液相色谱仪。

测定6种皂苷的含量，计算RSD，进行加样回收率考察，结果重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ、H加样回收率依次为99.82%、99.73%、100.01%、99.92%、100.08%、99.99%，RSD依次为0.73%、0.85%、0.65%、0.58%、0.91%、0.63%。

2.7样品含量测定取5批采于黔地山区重楼粉末约5g，精密称定，分别按”2.4.3项”方法测定重楼皂I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ、H的含量，见表1。

3 结果与讨论
2010版中国药典收载了重楼的质量标准，但对于黔重楼并没有详细说明，含量测定选择了4种重楼皂苷。

本研究采用梯度洗脱，对贵州地产重楼样品中的6种皂苷同时进行了含量测定，结果显示贵州地产重楼中6种皂苷的含量均符合药典标准。

在贵州地产重楼中检出了重楼皂苷H，能够直接诱导血小板聚集，将来可以作为抗血栓的原料药。

同时重楼皂苷Ⅱ含量最高，说明贵州地产重楼具有的免疫调节作用，有很好的应用前景。

参考文献：
[1]中国药典[S].一部，2010.
[2]国家中医药管理局.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，2000，22：7196.
[3]王羽，张彦军，高文远，等.滇重楼的抗肿瘤活性成分研究[J].中国中药杂志，2007，32（14）：1425-1428.
[4]沈放，杨黎江，彭永芳，等.重楼皂苷类化合物溶血作用研究[J].时珍国医国药，2010，21（9）：2280-2281.
[5]张兰天，左予桐，高文远，等.云南重楼提取物及化学成分的抗肿瘤活性研究[J].中草药，2007，38（3）：422-424.编辑/哈涛。