酶抑制剂的筛选初1

Shi-Kun MA等人使用计算机虚拟筛选对HIV-1整 合酶的抑制剂进行了筛选。HIV-1整合酶（IN） 是一个用于HIV感染治疗和艾滋病预防的重要靶 酶。筛选流程如下：
酶的三维 结构测定 构建四聚体模型 和毒蛋白质的DNA 复合体模型 构建药效 基团模型 数据库中 筛选化合物
实验结果
分子动力 学模拟
4.为了更好的抑制合成产物的生成。可以用 两种或两种以上的抑制剂作用于一条酶反 应途径的不同环节。通过协同作用，使两 种抑制剂均在较低的浓度下得到更好的抑 制效果和临床疗效。 5.作用于体内与药物代谢有关的酶系。药物 代谢酶的作用是催化药物或外源性物质进 行生物转化并使其排泄出体外。为防止药 物被代谢失活，延长药物的作用时间，可 使用药物代谢酶的抑制剂来延长药物的半 衰期或减少给药次数。
活性化合物
Quality Leads
高通量药物筛选一般过程
复 深入筛选
先导化合物
Lead compounds
筛
活性样品
Hits
初
筛
活性化合物
Active Compounds
确证筛选
候选药物
酶抑制剂的分类
四，按与酶作用机制分类 1.不可逆抑制作用 这类抑制剂与酶的某些基团以共价的方式结合，一经结合后就很 难自发分解，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制而使酶恢复 活性，它的抑制程度随着抑制剂的浓度以及抑制时间的增强而增 强。 2.可逆抑制作用 这类抑制剂与酶的结合是可逆的，结合后可以用透析，超滤等简 单的物理学方法去除抑制剂使酶全部恢复活性。这种结合往往是 非共价键的结合，这类抑制剂与酶分子的结合部位可以是酶的活 性中心，又可以是酶的非活性中心。由于这类抑制剂与游离态酶 之间存在着平衡关系，因此它的抑制程度是由酶和抑制剂之间的 亲和力的大小，抑制剂的浓度以及底物浓度所决定的，与作用时 间无关。
目前应用的筛选方法
3.应用质谱技术进行酶抑制剂的筛选 采用HPLC—MS联用技术中的质谱阀切换功能进 行样品脱盐前处理，通过优化液相梯度、质谱 检测条件以及激酶反应体系等，建立了激酶抑 制剂的色谱．质谱联机筛选方法。研究中对 LC．MS筛选体系进行了系统的方法学考察，并 对筛选模型的稳定性进行了评价。结果表明， 该方法线性、重复性良好。Z `因子评价表明 该方法可用于高通量筛选。
设计酶抑制剂筛选方法 的基本原理
在筛选酶抑制剂时,首先要分离或精 制得一定量的筛选酶，然后再根据 筛选酶与特定底物的特异性反应后 所生成的反应物来设计反应程序,最 后从反应体系中底物的减少或消失 和生成的产物的数量来判断待筛物 的抑制活性强弱。
筛选模型的建立
筛选模型就是在筛选实验中所应用的实 验模型，由于抑制剂筛选要求实验方案 有标准化和定量化的特征，因而在传统 药理实验中常见的动物实验在抑制剂筛 选中较少应用，根据实验模型的不同， 药物筛选可以分为分子水平的筛选和细 胞水平的筛选。
筛选使用的检测方法
酶抑制剂药物筛选常用的检测方法 检测方式是 酶抑制剂筛选中的关键技术之一，只有通过合 适的检测方法，才能将化合物与靶标、细胞间 的作用结果定量地反映出来，达到评价药品药 用价值的目的。目前，大多数的高通量筛选反 应是在96孔或384孔微孔板上进行的。新药筛 选的自动化程度和可靠性不断提高，与之相适 应的检测方法也得到了飞速的发展。酶抑制剂 高通量筛选中常用的检测方法有反射性同位素 检测法、比色检测法、荧光检测法、发光检测 法、质谱法等。
具代表性的酶抑制剂
2.HMG-CoA还原酶抑制剂 即羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂是 （hydroxymethylglutaryl coenzyme inhibitor）肝细胞 合成胆固醇过程中的限速酶，作用是催化生成甲羟戊 酸，抑制HMG-CoA还原酶能阻碍胆固醇合成。 是近年来上市的一类新型降血脂药物，这类药物通过 抑制HMG-COA还原酶而阻断或减少体内胆固醇的合成， 用此类药物治疗高血脂病时同时可降低冠心病和心肌 梗死的发病率和死亡率，这类药物的发现，是长期以 来寻找降血脂药物研究的一个突破性进展。
抑制剂发现技术概览
抑制剂发现
酶抑制剂筛选常用方法及实例
1.计算机辅助药物设计（computer aided drug design）是以计算机化学为基础，通过计算机 的模拟、计算和预算药物与受体生物大分子之 间的关系，设计和优化先导化合物的方法。计 算机辅助药物设计实际上就是通过模拟和计算 受体与配体的这种相互作用，进行先导化合物 的优化与设计。计算机辅助药物设计大致包括 活性位点分析法、数据库搜寻、全新药物设计
具代表性的酶抑制剂
3.人类免疫缺陷病毒（HIV）复制抑制剂 HIV病毒是一种逆转录病毒，它攻击人的免疫系统，引 起获得性免疫缺陷综合症，即艾滋病。HIV自身能产生 三种酶：逆转录酶，蛋白酶和整合酶，以帮助HIV病毒 突破人体内的免疫防线。故HIV复制抑制剂有三种： （1）逆转录酶抑制剂（RTI）（2）蛋白酶抑制剂 （3）整合酶抑制剂 目前国际上治疗艾滋病的药物共17种，尚未有治疗艾 滋的特效药，高效抗逆转录病毒疗法，逆转录酶抑制 剂法及蛋白酶抑制剂的联合治疗，是目前治疗中的基 本治疗，其他均为辅助治疗，如免疫增强剂及中草药 等。
目前应用的筛选方法

在测定HIV-1逆转录酶时应用生物素-链 霉亲和素系统将铕螯合物标记在DNA上， 以时间分辨模式测定结合的铕螯合物的 荧光强度，得到HIV-1逆转录酶的活性， 该方法可直接用于天然产物粗提物的 HIV-1逆转录酶抑制活性的筛选，而不受 内源性生物素的干扰。
目前程中有的会产生 一些副产物，根据其副产物的特性荧光 在一定波长下测量其吸光度值。具体例 子如下。
酶抑制剂的分类
二，按抑制剂的类型分类 按照酶所催化反应的类型，可分为氧化还原酶 抑制剂，转移酶抑制剂，水解酶抑制剂，裂解 酶抑制剂，异构酶抑制剂和合成酶抑制剂六大 类 三，按对疾病治疗作用分类 这种分类很多，一般有：降血脂作用的酶抑制 剂，抗血栓作用的酶抑制剂，抗肿瘤作用的酶 抑制剂，HIV复制的酶抑制剂，抗炎症的酶抑 制剂和其他酶抑制剂。
1.比色检测法 比色检测法是最经典的酶检测方法，主要通过 测定反应底物或产物在紫外或可见光下的吸收 值，通过在特定波长下检测吸光值的变化．间 接地反应体系中酶的活性。比色检测法的关键 是在筛选反应体系中含有特定吸收波长、可用 于检测的化合物。对仪器要求简单，普通的酶 标仪就能够满足一般的高通量筛选的要求，也 是最为方便的检测方法之一，但是该方法的灵 敏度有时相对较低，有时为了达到信号在线性 范围内，需要较大的酶量和底物浓度。
筛选出9个 化合物
2.高通量筛选(High throughput screening， HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方 法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以 自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的 检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处 理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品， 并以得到的相应数据库支持运转的技术体系， 它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言 之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并 从中找到有价值的信息。
酶抑制剂的作用方式
1.直接抑制病原微生物或人体内生物合成 途径中的某种关键酶，减少某种产物的 生成。 2.通过抑制人体内生物合成途径中的某种 酶使人体有益的底物得以积累，从而达 到治疗的目的。 3.通过抑制与某种生物合成途径直接相关 且必需的另一个生化反应的酶来减少有 害物的生成。
酶抑制剂的作用方式
筛选方法分类
1.分子水平酶抑制剂药物筛选 与细胞水平的筛选模型相比，分子水平的筛选 模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、 可实现大规模筛选的特点。但是该方法本身也 存在一定的缺陷：天然状态下的酶所处的环境 往往与筛选溶液的环境有较大的差别；筛选模 型中使用的酶可能没有代表靶酶的体内真实情 况；此外，在体外分子水平的筛选中，由于化 合物与靶酶在溶液中过于接近，得到假阳性结 果的概率相对较高。

目前应用的筛选方法
5.丝印电极法体外筛选 黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶( XO )的催化作用 下生成UA，XO抑制剂(如别嘌呤醇)可生 成黄嘌呤的结构类似物，从而竞争性抑 制黄嘌呤氧化，阻断UA的生成．实验测 定的底物为黄嘌呤和筛选物的混合溶液， 加入XO后，通过电极测定生成的UA量， 从而考察筛选物对XO的抑制情况．
酶抑制剂的筛选
酶抑制剂
酶抑制剂是指特异性作用于酶的某些基 团，降低酶的活性甚至使酶完全丧失活 性的物质。由于抑制特定酶的活性可以 校正新陈代谢的不平衡，许多相关药物 就是酶抑制剂。但并非所有能和酶结合 的分子都是酶抑制剂。
酶的抑制剂及其抑制作用对生物体很重要，机 体往往只要有一种酶被抑制就会代谢不正常， 以致表现病态，严重时甚至使机体休克死亡。 有不少酶的抑制剂以用于杀虫，灭菌和临床治 病。因此研究酶的抑制作用，既有理论意义， 又有重要的应用价值。它的研究已成为酶工程 的一个重要分支。其研究成果在工业生产上是 代谢调控提高发酵产物质量的有效措施之一， 同时在农业生产，医药设计及军事领域也应用 广泛。其前景非常广阔。
目前应用的筛选方法
荧光法一： ELISA法 一般在底物和酶反应过程中或在反应结 束后加入加入辣根氧化酶孵育培养一定 时间后再加入酸终止反应，产生的荧光 物质在490nm处测定吸光值

目前应用的筛选方法
荧光法二： α-淀粉酶抑制剂筛选 可溶性淀粉在胰α-淀粉酶作用下水解产生 的还原基团，将3，5一二硝基水杨酸还 原为硝基氨基水杨酸产生颜色变化，在 波长546 am处测定吸光度值。
酶抑制剂的来源
目前，酶抑制剂主要来源于植物、微生物和化学合成。 微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物 和次级代谢产物，研究最多的是放线菌，也是产生微 生物药物最多的类群，其中最重要的是链霉菌属 （streptomyces）；细菌、真菌也是酶抑制剂的重要 药源微生物。除了传统的药源菌筛选分离外，研究人 员的注意力更集中到了各种新的微生物类群中，如海 洋微生物、极端微生物。自然界植物种类丰富，但仅 有不到10%被测定过某种生物活性，从植物中筛选酶 抑制剂存在巨大的潜力，在未来相当长时间内仍是酶 抑制剂新药的主要来源。
2.发光检测法 新药筛选领域中使用的发光检测法主要是基于 荧光素在荧光素酶催化下所产生的发光反应。 荧光素酶催化的发光反应需要由ATP提供能量。 因此，有ATP产生的酶催化反应便可使用基于 荧光素和荧光素酶的发光检测法进行酶活性和 样品抑制活性的检测。目前，该方式常用于新 药筛选中对细胞中某一个报告基冈表达情况的 检测。
酶抑制剂的分类
一，按抑制剂的化学性质分类 1.无机化合物类 此类物质对脲酶有明显的抑制作用。如重金属 盐类。还有一些化合物如硼酸盐，氯化物，氟 化物，磷酸盐等具有抑制脲酶的作用。 2.有机化合物类 如异位酸类化合物，包括异丁酸，异戊酸，异 己酸等支链脂肪酸，它们有抑制脲酶活性的共 同结构特点，都有一个供氢基团；还包括尿素 衍生物，羟胺，多聚甲醛，醌，杂环硫醇等； 脲酶单克隆抗体对脲酶具有抑制作用，新近研 究赭曲霉素具有脲酶抑制作用
具代表性的酶抑制剂
1.β-内酰胺酶抑制剂 青霉素和头孢霉素等β-内酰胺类抗生素的发现 与使用为人类抵抗细菌感染做出了巨大的贡献， 挽救了无数人的生命。但在长期的使用中，细 菌逐渐对其产生了抗药性特别是β-内酰胺酶， 能够破坏抗生素中的内酰胺环结构，经常出现 使用效果不理想的现象。 β-内酰胺酶抑制剂是一类β-内酰胺类药物，可 与β-内酰胺酶发生牢固的结合而使酶失活，和 其他抗生素联用可增强其抗菌活性，减少其用 量。
高通量药物筛选基本程序
样品准备
Compound Archive
建立模型
Assay Development
模型优化
Assay Optimization
活性筛选
Screening
分析方法微量化
Assay Miniaturization
筛选结果 Profiling
分析技术
Assay Technologies