LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖、侵袭的影响及机制

1.2.4 Western Blot收集各组细胞样本，加入RI-
PA液裂解，于4 C、12000 r/min条件下离心
15 min,取上清液为细胞蛋白检测样本,BCA法测定
总蛋白含量。配制10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-
PAGE)，蛋白上样跑电泳,分离后转移至PVDF膜,
5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入稀释后的一抗(p-
摘要：目的 探讨LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞A2780和SKOV3的影响及机制研究。方法 将A2780和SKOV3 细胞分为正常对照组、LY294002组、顺铂组和LY294002+顺铂组，采用CCK-8法检测不同浓度的LY294002（10、20、40、60） ^moWL和顺铂（5、15、25、40） ^moWL处理后各组细胞的增殖能力并计算两种药物对于两种细胞的IC50值，采用划痕实验观 察细胞的增殖能力；采用Western Blot检测基质金属蛋白酶2（ Matrix metalloproteinase2, MMP2）、MMP9以及蛋白激酶B（Protein kinase B,AkMPKB）蛋白表达情况。结果 使用LY294002和顺铂均能明显抑制A2780、SKOV3细胞的增殖，并且呈剂量 依赖性；LY294002联合顺铂能够明显抑制卵巢癌细胞的迁移力（P<0.01），其抑制率优于单独使用LY294002或顺铂;MMP2、 MMP9和AKT蛋白表达水平在正常对照组、LY294002组、顺铂组及LY294002+顺铂组呈逐渐降低趋势，差异均有统计学意义 （P<0.05）。结论LY294002和顺铂单独用药均可抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖和侵袭，联合用药抑制增殖和侵袭 的作用更加明显。
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■♦- A2780 占 SKOV3
1.2.3细胞划痕实验测定迁移能力取对数生长
期的A2780和SKOV3细胞，将细胞接种到6孔板
中，每孔含有6X105个细胞，培养24 h后每孔垂直
于6孔板划3条平行线，然后用PBS洗去脱落细
胞，加入无血清培养液，根据CCK-8所测两种细胞
对于两种药物的 IC50 值确定加药浓度后分组， 分为
Abstract: Objective To investigate the effect and mechanism of LY294002 combined with cisplatin on ovarian cancer cells, A2780 and SKOV3. Methods A2780 and SKOV3 cells were divided into normal control group, LY294002 group, cisplatin group and LY294002+cisplatin group. CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of cells treated with different concentrations of LY294002 ( 10, 20, 40, 60 (Jimo^L) and cisplatin ( 5, 15, 25, 40 (Jimo^L). IC50 values of two drugs for two kinds of cells were calculated. The expressions of matrix metalloproteinase 2 ( MMP2) , MMP9 and protein kinase B (Akt/PKB) were detected by West­ ern blot. Results Both LY294002 and cisplatin could significantly inhibit the proliferation of A2780 and SKOV3 cells in a dose-de­ pendent manner ； LY294002 combined with cisplatin could significantly inhibit the migration of ovarian cancer cells ( P<0.01) , and the inhibition rate was better than that of LY294002 or cisplatin alone ； the expression levels of MMP2, MMP9 and Akt protein in the nor­ mal control group, LY294002 group, cisplatin group and combination group were gradually decreased The differences were statistically significant ( P<0.05) . Conclusion LY294002 and cisplatin alone can inhibit the proliferation and invasion of ovarian cancer cells A2780 and SKOV3, and the effect of combination is more obvious.
catin 1: 2000、MMP2 1： 800、MMP9 1： 800、AKT
Hale Waihona Puke 1:1000)4 C冰箱孵育过夜，用TBST液漂洗3次，每
次5 min；加入二抗室温抚育1 h,再用TBST液漂洗3
次， 每次 5 min，ECL 显影。 每个样本重复 3 次。 应用
Image J软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达量。
1.3统计学分析；采用SPSS 20.0软件进行统计学
分析并用 Graphpad prism
勺
计量资料以“均数土标准差”表示，多组间数据的比较
采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 LY294002和顺铂对卵巢癌A2780、SKOV3细 胞增殖的影响 结果表明，LY294002和顺铂对细胞 增殖的抑制作用随着药物浓度升高而增加,并且呈 剂量依赖性，当LY294002浓度在30 imol/L时对两 种细胞均有明显的抑制作用,而后随药物浓度的增 加对A2780细胞的抑制作用要强于SKOV3细胞。 当顺铂浓度在15 imol/L时对两种细胞均有明显的 抑制作用,超过20 imol/L时,对A2780细胞的抑制 率明显高于SKOV3细胞。LY294002和顺铂对 A2780、SKOV3细胞的增殖抑制率见图1。
发展为耐药［3-4］。因此寻找有效的的途径增强卵巢 癌对顺铂的敏感性,抑制其耐药并探讨其分子机制, 成为研究的热点。PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶/ 丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶）信号转导通路被认为是 肿瘤细胞存活和介导其耐药的关键通路，相关研究 表明LY294002（ PI3K泛抑制剂）可以增强某些抗肿
1材料与方法
1.1 ::料 1.1.1细胞系 人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3 由哈尔滨医科大学病理教研室馈赠 。 1.1.2 主要试剂 LY294002购自MCE公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Biosharp公司；顺铂、 胰蛋白酶、CCK- 8试剂盒购自meilunbio公司；0 actin、 MMP2、 MMP9、 AKT 抗 体 购 自 proteintech 公 司。 1.2 方法 1.2.1细胞培养 A2780和SKOV3细胞常规培养 于5% CO2、37 C培养箱中，用含10%胎牛血清和 1%青/链霉素的RPMI-1640的培养基培养,2~3 d 换液，待细胞融合度达80%~90%时用0.25%胰酶 进行消化、传代，取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 CCK-8测定细胞增殖抑制率取对数生长 期细胞，用0.25%胰酶消化后离心，用含10%胎牛血 清的RPMI1640完全培养基稀释成单细胞悬液，接 种到96孔板中,调整细胞浓度至8000个/孔,每孔 加入RPMI1640培养液100 iL,并设置空白对照。 培养24 h后弃去原培养液，每孔加入不同浓度的 LY294002( 10、20、40、60 »mol/L)和顺铂(5、15、25、 40 imol/L) 100 iL含药培养液，每个浓度设5个复 孔;无细胞孔加入不含药物的培养液。继续培养 24 h后弃去原培养液，每孔加入含10 iL CCK-8溶 液的RPMI1640培养基100 iL,继续培养2 h后，用 酶标仪检测450 nm下各孔的0D值。计算细胞增 殖抑制率，细胞增殖抑制率=1-(0D实验组-OD空 白对照组)/(0D正常对照组-0D空白对照组)X 100%。用 Graphpad prism 浓度)值并绘制细胞增殖抑制曲线。
基金项目：牡丹江医学院研究生创新科研项目（2019YJSCX-18MY）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（2019-KYYW'FMY0033）；黑龙江省卫生健康委科研课题（2019-319）
作者简介：范竞文（1992-），女，硕士研究生，研究方向：肿瘤侵袭转移及耐药机制研究。 通讯作者:冯华，E-mail ：fenghua9756024@ 。
2021 年 6 月 第 42 卷 第 3 期
牡丹江医学院学报 Journal of MuDanJiang Medical University
Jun.2021 Vol. 42 No. 3 2021
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LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖、侵袭的影响及 机制
范竞文1，方 超1，李婉玉-任春慧2，冯 晨2，冯 华1 （1.牡丹江医学院;2.牡丹江医学院附属红旗医院,黑龙江 牡丹江157011）
Key words: LY294002；Cisplatin；Ovarian cancer；Proliferation；Invasion
卵巢癌（ovarian cancer, OC）是女性生殖系统中 致死率最高的恶性肿瘤［1］。发病早期隐匿，缺乏典 型的临床症状和有效的筛查与诊断方法，约70%患 者初诊时已处于晚期［2］。顺铂作为卵巢癌临床治 疗的一线用药，在卵巢癌的化疗中发挥了重要的作 用,大多数卵巢癌患者起初对顺铂敏感，但是最终常
正常对照组、LY294002组(20 imol/L)、顺铂组
(10 imol/L )、LY294002 + 顺铂组(20 imol/L +
10 imol/L)。最后将所有细胞放入含5% CO2,
37 C的培养箱中，分别记录干预24 h、48 h后的细
胞划痕愈合情况，用Image J软件进行相关分析。
关键词：LY294002；顺铂；卵巢癌;增殖；侵袭 中图分类号：R737.31 文献标识码：A 文章编号：1001-7550（ 2021） 03-0013-05
Effects of LY294002 combined with Cisplatin on Proliferation and invasion of Ovarian Cancer cells A2780 and SKOV3 and its Mechanism FAN Jing-wen et al (Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China)
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2021 年 6 月 第42卷第3期
牡丹江医学院学报 J ournal of MuDanJiang Medical U niversity
Jun. 2021 Vol. 42 No. 3 2021
瘤药物的疗效，减少化疗抵抗作用［5-7］。但目前对 LY294002联合顺铂对卵巢癌增殖和侵袭影响的具 体机制研究甚少。因此本研究旨在观察LY294002 联合顺铂对卵巢癌细胞增殖、侵袭的影响，并以 PI3K/AKT通路为靶点，探讨其作用机制,为其临床 应用提供理论依据。
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■♦- A2780