丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护机制

丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护机制为研究丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞（rBMECs）的保护机制。

该实验采用原代培养乳鼠脑微血管内皮细胞并进行Ⅷ因子鉴定，建立缺氧4 h损伤模型的同时，丹红注射液（25，50，100 mL·L-1）作用于rBMECs，生化法检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平，RT-PCR法检测细胞MMP-9，ICAM-1，P53 mRNA表达水平，透射电镜观察细胞超显微结构变化。

结果表明缺氧使原代培养的rBMECs受到明显损伤，与模型组比较，丹红注射液（50，100 mL·L-1）可显著对抗缺氧造成的损伤，增强SOD活性，降低MDA 水平，明显下调MMP-9，ICAM-1，P53 mRNA的表达，丹红注射液100 mL·L-1能够保护细胞正常的形态、显微结构、维持细胞间紧密连接，抑制缺氧诱导的细胞凋亡。

从结果中可以得出丹红注射液对缺氧损伤rBMECs具有明显的保护作用，其机制与增强细胞抗氧化能力，抑制炎症反应及细胞凋亡有关。

标签：丹红注射液;乳鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）;缺氧;抗氧化;炎症;细胞凋亡
1 材料
1.1 动物SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK（沪）2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.2 药品与试剂丹红注射液（菏泽步长制药有限公司，国药准字Z20026866，批号12091021）;M199培养基、胎牛血清（Gibco公司）;D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭（PI）、Folin-酚试剂、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、胰蛋白酶（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）;丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）;High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit（Roche公司）;All-in-OneTM Q-PCR Primer Array（GeneCopoeia公司）;β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′;ICAM-1上游引物5′-TCTCATGCCCGTGAAATTATG-3′，下游引物5′-TTGATTCAAAGGAAAGGCTTCT-3′;MMP-9上游引物5′-ATCTGTATGGTCGTGG- CTCTAA-3′，下游引物5′-TGGCTTCCTCCGTGATTCG-3′;P53上游引物5′-CAGCTTTGAGGTTGGTGTTTGT-3′，下游引物5′-ATGCTCTTCTTTTTTGC- GGAAA-3′;其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化设备有限公司）;3111型CO2培养箱（Thermo Scientific公司）;DMI4000B荧光倒置显微镜（德国徕卡公司）;LDZ5-2型低速自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司）;TU-1900双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;Thermo Scientific
Varioskan Flash酶标仪;荧光定量PCR仪（BIO-RAD）;JEM-1230型透射电镜（日本JEOL公司）;eppendorf移液枪，自制缺氧罐。

2 方法
2.1 rBMECs的原代培养[4] 取8只3～5日龄SD乳鼠，脱颈椎处死，置于75%乙醇中浸泡3～5 min后，无菌条件下沿大鼠脑正中线剪开颅骨，剔除硬脑膜，取出大脑半球，去除小脑和脑干，用细解剖镊尽量去除软脑膜、大血管、白质组织。

用D-Hank′s液漂洗3次后，将大脑皮质移入无菌的培养皿中，用虹膜剪将其剪碎至1 mm3（以上操作在冰袋上进行）。

剪碎的灰质组织用含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。

将沉淀悬浮于0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，吹打均匀，37 ℃消化25 min，5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。

将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种到细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱内静置培养，常规4 d 后首次换液，以后每2 d换液1次，约7～8 d细胞生长成致密单层后，用胰酶消化传代培养，以3～4代细胞用于实验。

倒置显微镜下观察：传代细胞呈多角形或短梭形，汇合状态呈现“铺路石”征象;Ⅷ因子抗体及二抗IgG-FITC免疫荧光鉴定：细胞核出现红色荧光，胞质出现强绿色荧光，呈阳性;均符合脑微血管内皮细胞的形态和生化特征，证明是脑微血管内皮细胞。

2.2 分组与建立缺氧损伤模型[4] 将传至第3代的rBMECs调至1×105个/mL，1 mL/孔，接种至6孔板上，待细胞长成致密单层后用于以下实验。

经MTT 实验确定细胞的毒性剂量范围及造模预实验确定加药浓度，取丹红注射液和M199培养基分别配成高、中、低（100，50，25 mL·L-1）浓度的含药无血清培养基。

分为对照组、模型组和丹红注射液高、中、低浓度组。

给药前轻轻吸去培养基，用PBS洗涤2次后，正常组加入完全培养基1 mL，模型组加入无血清培养基1 mL，丹红注射液组分别加入高中低浓度的含药无血清培养基1 mL。

正常组仍置于37 ℃，5%CO2培养箱内静置培养4 h;其他组均置于37 ℃的自制密闭缺氧罐中，持续通入95%N2+5%CO2的混合气体充满缺氧罐，15 min后封口膜密封缺氧罐接口置37 ℃恒温箱中4h。

倒置显微镜下观察各组细胞形态：缺氧损伤后，贴壁rBMECs变圆甚至脱落，漂浮在培养基中，细胞体积明显缩小，紧密连接消失，与周围的细胞脱离;丹红注射液能有效减轻缺氧对细胞形态的损伤。

2.3 指标检测取各组细胞，PBS洗3次，加入细胞裂解液裂解细胞，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD水平、硫代巴比妥酸法测定MDA含量、Folin-酚法检测蛋白含量。

脑微血管内皮细胞ICAM-1，MMP-9，P53 mRNA表达采用Real-time PCR检测，以β-actin作为内参，相对表达量（2-ΔΔCt）来表示目的基因mRNA 的表达水平。

正常组、模型组和丹红注射液100 mL·L-1组细胞超显微结构采用透射电子显微镜观察。

2.4 统计学处理数据用SPSS 1
3.0统计软件处理，结果用±s表示，不同组间两两比较采用LSD（最小显著性法）单因素方差分析（One-Way ANOV A）。

3 结果
3.1 丹红注射液对缺氧损伤rBMECs SOD活性和MDA水平的影响与正常组比较，模型组rBMECs由于缺氧造成细胞内SOD的活性明显降低，MDA水平显著升高（P<0.01），表明缺氧造成rBMECs产生大量氧自由基，与脂质、蛋白质及核酸发生反应，引发脂质过氧化作用，清除氧自由基的能力显著下降，细胞发生氧化应激损伤。

丹红注射液100，50 mL·L-1均能显著增强SOD的活性，降低MDA水平（P<0.01）;而丹红注射液25 mL·L-1组未见明显的作用，见表1。

3.2 丹红注射液对缺氧损伤rBMECs ICAM-1，MMP-9 mRNA表达的影响与正常组比较，缺氧模型组ICAM-1，MMP-9 mRNA的表达明显上调（P<0.01）。

ICAM-1 mRNA表达上调主要是介导缺氧后细胞发生黏附反应，影响细胞迁移，促进细胞活化。

MMP-9 mRNA表达上调是缺氧后调节细胞因子活性，释放血管内皮生长因子（VEGF）以维持血管生成。

丹红注射液100，50 mL·L-1均能显著下调ICAM-1，MMP-9 mRNA的表达（P<0.01）;丹红注射液25 mL·L-1能下调MMP-9 mRNA的表达（P<0.05），见表2。

3.3 丹红注射液对缺氧损伤rBMECs P53 mRNA表达的影响与正常组比较，缺氧模型组P53 mRNA的表达明显上调（P<0.01）。

缺氧后细胞P53 mRNA表达明显上调的后果是引起G1/S期阻滞和促进细胞凋亡。

丹红注射液100，50 mL·L-1均能显著下调P53 mRNA的表达（P<0.01）;而丹红注射液25 mL·L-1组未见明显的作用，见表3。

3.4 丹红注射液对缺氧损伤rBMECs超显微结构的影响用透射电镜观察丹红注射液对缺氧损伤细胞显微结构的保护影响，正常细胞细胞质与细胞核染色质分布均匀;与正常细胞比较，缺氧细胞表面平滑，细胞质浓缩，细胞核染色质固缩，常聚集于核膜呈境界分明的颗粒状，随后细胞核和细胞外形皱折，细胞膜突出形成质膜小泡，即细胞“出泡”现象，细胞核染色质明显边集，这是细胞早期凋亡进程的典型现象;与缺氧细胞比较，丹红注射液100 mL·L-1组细胞细胞核染色质并没有出现明显边集，视野下2个脑微血管内皮细胞紧密连接并没有消失，且在同样倍数视野下，细胞出现早期凋亡的数目远远小于缺氧组细胞早期凋亡数。

说明100 mL·L-1丹红注射液能够明显抑制缺氧引起的细胞早期凋亡，保护细胞正常的形态、结构和生理功能，见图1。

4 讨论
血脑屏障的破坏是缺血缺氧损伤性脑病发生的重要病理生理基础，建立体外脑微血管内皮细胞模型，研究血脑屏障的结构、功能特性和损伤机制，对于进一步研究由于屏障功能破坏造成的脑损伤疾病和进行药物治疗有着重大意义[5]。

大脑的新陈代谢速率快且含大量的不饱和脂质，易成为脂质过反应的目标。

脑缺血缺氧时，细胞氧化磷酸化能力减弱，ATP合成减少，离子泵功能失效，细胞膜电位下降，产生去极化，导致突触前释放兴奋性氨基酸，受体活化效应引发大量的Ca2+内流，过量Ca2+沉积于线粒体，使线粒体氧化磷酸化失偶联进一步加重，膜电位丧失，呼吸链解体，导致细胞能量的严重丢失，产生大量的自由基与脂质、蛋白质、及核酸发生反应，引起膜脂质过氧化，导致膜损伤等一系列损害，为自由基连锁反应。

MDA是脂质过氧化物中的主要一种，对细胞有损伤作用，引起一系列细胞结构和功能的破坏。

测定MDA的量可反映出细胞损伤的程度。

机体内存在着一系列的自由基清除系统，使自由基的产生与清除保持着动态平衡，其中SOD对自由基的清除起重要作用，SOD 水平常作为清除氧自由基能力的主要指标[6-9]。

因此细胞MDA含量、SOD水平可反映出血脑屏障破坏程度。

ICAM-1是介导黏附反应重要的一个黏附分子，在促进炎症部位的黏连性，调节机体免疫反应中起重要作用。

内皮细胞上的ICAM-1介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触与结合，从而参与细胞的信号转导与活化、免疫反应、炎症反应、血管生成等生理病理过程[10-11]。

白细胞浸润、脑水肿严重程度与ICAM-1表达呈现明显相关性，降低ICAM-1表达有助于保护血脑屏障。

基质金属蛋白酶MMP-9的生理作用广泛，能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性，尤其MMP-9可通过释放血管内皮生长因子（VEGF）以参与血管生成维持血脑屏障[12-13]。

早期脑损伤病理生理学包括血脑屏障的破坏、脑水肿及神经细胞凋亡，P53被认为是抑制和促进细胞凋亡最重要的基因。

P53是一种肿瘤抑制基因，具有与单链或双链DNA结合的能力，与细胞分裂周期有关。

在细胞周期中，P53 的调节功能主要体现在G1和G2/M 期校正点的监测，一旦转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞。

P53促进细胞凋亡的功能研究比较深入，通过Bax/Bcl2，Fas/Apol 等蛋白，P53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用[14]。

本实验结果表明，丹红注射液对缺氧损伤rBMECs具有明显保护作用，显著增强胞内SOD活性，降低MDA水平，改善能量代谢，增强清除氧自由基能力，减轻脂质过氧化反应;能显著下调缺氧细胞ICAM-1，MMP-9 mRNA的表达，介导黏附反应、促进内皮细胞迁移、降低内皮细胞活性，促进血管生成等;还能显著下调P53 mRNA表达，抑制细胞凋亡;保护细胞正常的形态和结构。

综上所述，丹红注射液对缺氧损伤血脑屏障具有明显的保护作用，其机制可能与保护血脑屏障结构，减少氧自由基生成，提高细胞清除氧自由基能力，介导黏附反应，促进血管生成及抑制细胞凋亡有关。

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endothelial cells injured by hypoxic
ZHOU Peng，HE Yu，YANG Jie-hong，ZHANG Yu-yan，ZHOU Hui-fen，ZHAO Tao，FU Wei，WAN Hai-tong
（1. Institute of Cardiovascular-Cranial Disease，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China;
2. Shandong Buchang Pharma Co.，Ltd.，Shandong 274000，China）
[Abstract] To study the protective mechanism of Danhong injection on brain microvascular endothelial cells （rBMECs）injured by hypoxic. In the experiment，primary suckling mouse′s rBMEC s cells were collected and identified with factor Ⅷto establish the 4 h injury model. Meanwhile，rBMECs were given Danhong injection （25，50，100 mL·L-1），and the superoxide dismutase （SOD）activity and the malonyldialdehyde （MDA）level were detected by the biochemical method. Cell MMP-9，ICAM-1 and P53 mRNA expression levels were detected by RT-PCR method. Changes in cells′ microscopic structure were observed by transmission electron microscope. According to the results，primary rBMECs were notably injured by hypoxia. Compared with model group，Danhong injection （50，100 mL·L-1）could remarkably resist the injury induced by hypoxic，increase intracellular SOD activity，decrease MDA level and significantly down-regulate ICAM-1，MMP-9 and P53 mRNA expressions. Danhong injection （100 mL·L-1）could protect the cells′ normal morphology and microscopic structure，maintain the close intercellular junction，and inhibit the hypoxia-induced cell apoptosis. The results showed that Danhong injection plays a significant role in protecting rBMECs injured by hypoxia. Its mechanism may be related to the enhancement of cells′ antioxidant capacity，the inhibition of inflammatory response and the cell apoptosis.
[Key words] Danhong injection; suckling mouse brain microvascular endothelial cell （rBMECs）; hypoxia; anti-oxidation; inflammation; cell apoptosis doi：10.4268/cjcmm20142428。