流式细胞技术在血小板研究中的应用

流式细胞技术在血小板研究中的应用
血小板在各种诱导剂作用下释放其颗粒内容物，产生生物学效应，在初期止血过程中发生粘附-变形-释放-聚集等反应，这些血小板的基本反应，统称为血小板活化反应。

血小板活化的检测对血小板相关疾病的诊断有重要价值。

然而，检测的方法常常是有争议的，通常是由于方法本身不完善或应用不当导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。

这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板活化的方法。

近几年来，随着流式细胞技术（Flow cytometry，FCM）的发展，FCM已广泛应用于基础与临床研究，并逐渐成为检测血小板活化的重要手段。

现就FCM检测血小板活化的方法及临床应用作一综述。

一、活化血小板标记物
活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。

主要包括三类：
1、第一类是血小板质膜表面糖蛋白
（1）GPⅡb/Ⅲa（CD41-CD61）它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，因此，使用其荧光单抗，就能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。

（2）GPIb-IX-V （CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。

可以作为活化血小板的分子标志。

（3）GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高，也可以作为血小板活化标志。

（4）另外还有GPⅠc/Ⅱa（CD49e-CD29）、GPⅠa/Ⅱa（CD49b-CD29）等与血小板活化有关。

2、第二类是血小板颗粒膜糖蛋白
主要包括血小板α-颗粒膜蛋白（GMP-140，CD62）和溶酶体完整膜蛋白（LIMP，CD63）。

血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。

3、第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原
包括纤维蛋白原，Xa因子等，这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。

膜糖蛋白CD单抗功能
GPIIb/IIIa CD41/CD61* 聚集
GPIb/IX CD42b-CD42a 粘附
GPIa/Ⅱa CD49b-CD29 粘附
GPIc/Ⅱa CD49e-CD29 粘附
GPⅣCD36 粘附
GPⅤCD42d 凝血酶底物
GMP-140 CD62p 血小板与炎性细胞相互作用
GP53 CD62
* CD41即是GPIIb/IIIa的单抗又是GPIIb的单抗，CD61是GP IIIa的单抗
二、流式细胞术检测血小板活化
1、常规方法
由于血小板的活化程度可由血小板膜相关糖蛋白表达水平的高低来判断，FCM测定相关糖蛋白的表达情况就成为检查血小板功能的一种新手段。

血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM 可以通过单抗免疫荧光标记（如抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅡb、抗GPⅢa、CD62P、CD63等）测定平均荧光强度或特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率来检测血小板的活化情况。

检验过程：样本制备（全血法、洗涤血小板法、富含血小板血浆法）→荧光染色（FITC、PE、PerCP）→流式检测→数据分析。

传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。

由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。

为此，Shatti等引入了全血法流式细胞术。

该技术能尽可能的避免血小板体外医源性激活，防止血小板亚群丢失；在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板活化状态。

同时不会受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。

但是如果采血后不能立即检测（3小时内），则需用固定法，可以在5天内检测，但固定法的步骤较为繁琐，耗费时间，且容易人为活化，所以很多实验室还是倾向于全血法。

血小板结合位点绝对数的测定一直是个难题，而用普通的FCM只能得出一个相对值。

Shatti等发现碘标测定的血小板结合位点数与荧光强度间有线性关系。

因此，可以通过这一线性关系，在流式细胞仪定量分析后换算该抗体结合位点的绝对数目。

2、三色流式分析方法检测血小板活化
三色流式分析法是在常规FCM检测基础上发展起来的一种多参数分析，可以更全面、更系统的获得血小板相关信息。

血小板活化试剂组
（1）PAC-1-FITC抗体：IgM型，与活化的GPⅡb/Ⅲa复合物结合，是早期血小板活化标志物。

R
GDS为PAC-1FITC抗体结合阻断剂，作阴性对照。

（2）CD62P-PE抗体：IgG1型。

血小板活化时表面的CD62P结合，是血小板活化后期的标志物。

3）CD61-PerCP：IgG1型。

特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。

3、操作步骤
标本采集（全血法）→血小板体外活化→荧光染色（FITC、PE、PerCP三色荧光）→上机操作→分析数据。

荧光染色
BDIS抗体FITC PE PerCP
对照管PAC-1+RGDS IgG1 CD61
试验管PAC-1 CD62P CD61
三色流式细胞分析法可以同时检测血小板反应性及其活化进程，能直接、同时检测多种血小板表面标志，使用全血、样本量少，操作简便快捷，将血小板人工活化降至最低。

（1）血小板微粒的测定
血小板微粒（PMPs）是血小板被激活后从质膜脱落进入外周循环的细小微粒，由于PMPs可表达小板特异性膜糖蛋白（GPIb、GPIIb和GPⅢa等）并富含凝血因子膜受体，可为血酶原反应提供催化表面，所以在止血和血栓形成发挥重要作用。

大量研究证明[7]PMPs是监测栓性疾病的重要指标。

由于MPs极小直径大约为0.031mm，常规方法的灵敏度和分辨率不够，使得PMPs的检测受到限
制。

90年代后人们开始用流式细胞术对PMPs进行分析。

既往FCM检测PMPs常采用PRP或全血法，这些方法均以相对单位表示PMPs的表达量，不利于实验结果的室间比较，而且由于PMPs携带与血小板相同的膜糖蛋白而无法排除血小板对PMPs的干扰。

另外，由于PMPs极小，即使是高分辨的FCM，如果仪调整和设置不当也难以排除仪器噪音的干扰。

马文新等人发展的FCM内参定位法检测血小板微粒，成功的解决了上述问题，使FCM在PMPs测定及血小板活化监测方面得以推广，有利于实验结果的室间比较和检测方法的标准化。

（2）胞内钙离子的测定
除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。

由于血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于Ca2+敏感荧光探针，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。

另外，用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流，也可以检测血小板活化。

（3）阿的平来检测活化血小板的释放功能
阿的平能进入血小板致密颗粒，血小板活化时，与GMP-140等一同释放，用FCM可以通过检测荧光强度来显示血小板活化。

因此也可以作为一个非免疫性检测指标。

三、临床应用
1、血栓性疾病
心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在我国有很高的发病率，也是致死的重要原因。

血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。

血小板膜表面糖蛋白如GPⅡb/Ⅲa等有多个等位基因，其纯合子、杂合子[PI（A1A1），PI（A1A
2），PI（A2A2）]与否与一些血栓性疾病发病率有关，Schwipper等用流式细胞术与PCR-RFLP对220名患者分别检测，结果重和率85％，而FCM操作简单方便快速，因而可以对GT进行分类，并用做相关疾病高危性的筛选。

2、血小板缺陷性疾病
血小板无力症（GT）是由于GPIIb或GPⅢa基因缺陷导致血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）减少或质的异常，巨大血小板综合征（BSS）是由于GPⅠb/Ⅸ复合物缺陷，导致血小板功能异常，二者均引起血小板对多种诱导剂（如ADP、凝血酶、胶原等）的先天性、遗传性无凝集或反应降低。

因此可以用荧光单抗直接或间接标记血小板，用FCM直接检测血小板GP的缺陷，具有简单、快速、灵敏和特异性等优点，适合于临床GT的筛查，与血小板粘附、聚集试验结合应用，提高了确诊率，尤其是对不典型病例的诊断。

3、血小板输注
血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象，储存5天以上，大部分血小板活化，用FCM检测血小板活化指标如CD62等各种膜糖蛋白，可对有效血小板进行筛选，从而提高血小板输注的有效性。

4、抗血栓药物的监测
近年来出现的一些新的抗血栓药，能阻断GPⅡb/Ⅲa的功能，在抗血栓方面显示了良好的疗效。

对血栓性疾病进行血小板活化检测可以得知血栓形成的原因，判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。

而用FCM则可以快速、准确的进行检测，达到这一要求。

5、肝素诱导的血小板减少症（HIT）
肝素治疗最严重的并发症就是HIT和血栓症。

诊断此类并发症常用的方法是ELISA 和SRA法。

而
Tomer等却发现部分HIT患者ELISA 和SRA法阴性，而FCM检测血小板活化标志（如CD62p）表明血小板处于活化状态，停用肝素，症状缓解，从而确诊了本病。

FCM在不同实验室获得结果相同，因而可以用广泛作血小板减少性疾病的分类及指导治疗。

6、体外循环（CPB）检测血小板损伤
GPIb是血小板早期止血的关键性物质之一，利用全血流式细胞技术发现，围CBP期间血小板GPIb 发生了明显的变化。

CBP期间呈明显的损伤，CPB结束后24小时才回复至术前水平。

因此在CPB前后用FCM对GPIb进行检测可以观察非手术性出血的原因，并适时加强对血小板GPIb的保护。

7、自体外周血干细胞移植（APBSCT）后血小板恢复的指标预测
流式细胞仪检测CD34+细胞已被广泛地应用于预测PBSCT后的造血重建。

有人检测CD34+细胞表面不同的抗原表达水平，认为CD34+细胞表面血小板膜糖蛋白的表达可以作为预测血小板恢复的指标。

D ercksen等在CD34+细胞纯化的缓冲液中加EDTA，防止血小板粘附，发现在CD34+细胞表面CD41a、C D41b、CD42a及CD42b等4种血小板膜糖蛋白中CD34+/ CD41a+细胞的数量可能与血小板恢复的关系最密切，因此用FCM对移植后患者检测CD41a，可以作为一个预测移植成功的指标。

8、在其它一些免疫性疾病中的应用
系统性红斑狼疮常常累及造血系统，引起出血，主要原因是GPIIb/IIIa受损，部分血小板活化，并释放多种细胞因子，血管通透性增加，使患者血管炎或出血表现更为加重。

因此用FCM检测SLE患者血小板的活化程度并结合临床，可以判断疾病的发生、发展以及疗效。

并针对血小板的活化所致的血管炎或出血，加强抗炎及抗血小板治疗。

糖尿病微血管病变发生时血小板膜糖蛋白CD62P、CD63水平均明显高于正常，处于高度活化状态。

用流式细胞术（FCM）检测2型糖尿病患者血小板膜糖蛋白CD62P、CD63的表达对判断糖尿病的病情有
一定的临床意义，而且能够准确反映血小板活化的程度和血栓形成倾向，有助于糖尿病微血管病的早防早治。

另外，血小板功能的改变可先于血管病变的发生，对已发生微血管病变的糖尿病患者采取抗凝治疗并不能逆转病变但能阻止其进一步发展，而及早采取治疗措施则有可能预防微血管病变的发生。