生物素过氧化物酶
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（二）信号弱
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有： 1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高； 2. 抗原修复方式不当 ；
3. 抗原位于细胞内，未使用穿孔剂 如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗体渗透入细胞内，也 可降解内源性Fc受体； 4. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确 ；
（2）用3% H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗； （3）抗原修复处理，PBS洗； （4）正常山羊血清封闭 15min；
（5）滴加第一抗体，37℃ 孵育1h； （6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗体复合物 37℃，60min； （7）PBS洗（一定要充分），DAB显色； （8）苏木素衬染，脱水、透明、封固。
第十七页，共41页。
附 免疫多染技术
原理 用不同来源的抗体和不同的染色同时检测同一标本中
的多种抗原标记物。
第十八页，共41页。
第十九页，共41页。
第二节 葡萄球菌A蛋白 （SPA） 的应用
第二十页，共41页。
葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A，SPA） 一、特性：
第七页，共41页。
（二）标记生物素-抗生物素技术 （Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）
以生物素标 记抗体作第一抗体， 酶标记抗生物素作 为第二抗体，同SP技术
LAB法示意图
第八页，共41页。
2、操作步骤 （1）①-④ 步骤与ABC法相同 ；
（5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。
第二十五页，共41页。
（二）部分着色
1. 灶片装着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气泡，组织局部鼓起。 2. 阴阳着色：测试片未放平，滴加试剂偏向一侧。
（三）着色部位改变
1. 间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非特异 性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙；抗体不 纯或被污染；
第九页，共41页。
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术：
S-P （ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex）技术
第十页，共41页。
2、操作步骤
（1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ；
⑥ 确定标本的处理及储存条件；
⑦ 检查色原/底物溶液，底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效；
第二十三页，共41页。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不 应含有叠氮钠；
⑨ 检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性树胶， 荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。
第四页，共41页。
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术
1．基本原理
第五页，共41页。
2、操作步骤
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗；
（2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ；
（6） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （7） PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育 20min；
（8） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （9） PBS洗后，DAB/H2Ｏ2显色；
（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ；
（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素 和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ；
第二十二页，共41页。
2、假阴性结果：原因有两种： （1） 染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用H&E染色验证。 （2） 染色中错误： ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等； ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间； ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一 点是非常重要的； ④ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在4~8℃条件 下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效 价； ⑤ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适；
（10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。
第十五页，共41页。
（六） Envision技术
用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体 ， 具有很强的信 号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。
第十六页，共41页。
2、操作步骤 （1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗；
色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能 排除一种可能的原因。一定设对照，主要是阴性对照和阳性 对照。
（一）无信号
染色结果阳性对照/标本均无染色，出现无信号染色现象有两种原因：
1、真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号；或表达抗原太低，所 使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。
（7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。
第六页，共41页。
3、ABC法的优点 （1）敏感性高 :结合力强,分子量小;
（2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ；
（4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多 重免疫染色 。
1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定 ；
2、 能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合； 3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物 。
二、应用
SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物种属限 制。
第二十一页，共41页。
三、常见问题及处理
主要是无信号、信号弱、杂信号等三种。当免疫组化染
5. 切片上遗留了过多的冲洗液，；
6. 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
第二十四页，共41页。
三、杂信号 由于切片、内源性IgG、Fc受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素的存在
等原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生物素暴露，造成染 色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下：
生物素过氧化物酶
第一页，共41页。
亲和的概念
物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、生物 素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白与IgG、
植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结 合反应等。
第二页，共41页。
第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术
一、基本原理
（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素 （Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ；
（6） PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色；
（7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。
第十三页，共41页。
（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法
根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶 性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ，敏感性更高，尤其适合原始信号 较弱的信号检测，但操作较复杂。
第十一页，共41页。
（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
以生物素标记抗体作 第一抗体，抗生物素作为 第二抗体，桥接酶标生物 素。
第十二页，共41页。
2、操作步骤 （1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min；（4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min； （5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min；
第二十七页，共41页。
பைடு நூலகம்
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干 燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水 稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室 温过夜干燥。装盒备用。
（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 。
第三页，共41页。
二、几种经典的抗生物素－生物素染色法
（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术 （三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）：
第一步
第二步
第三步 第四步
第十四页，共41页。
第五步
2、操作步骤
（1） 常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理；
（2） 3% H2Ｏ2甲醇液15min； （3） 正常封闭血清，室温20min，甩干； （4） 滴加特异性一抗4℃过夜或37℃ 孵育1h； （5） PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃ 30min；
第二十八页，共41页。
2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、 10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟， 主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（一）全片着色 1.是否有效地去除了内源性酶和生物素 ；
2.封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清 ；
3.所选择的抗体是否符合试验要求 ，主要是抗体纯度； 4.一抗的使用浓度是否过高 ；
5.清洗是否充分 ，DBA的使用是否正确 ，边缘效应； 6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 ；
7.组织抗原弥散等。
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响， 极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用防脱片试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸 馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片 捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影 响染色结果。
2. 细胞浆着色 ：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白； 3. 细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡 时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有浸没在修复液中等。
第二十六页，共41页。
四、石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理：
S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
（五）CSA（Catalyzed signal amplification）法
（六） Envision技术
（4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ；
（5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃ 30min ； （7） PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC）， 37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有： 1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高； 2. 抗原修复方式不当 ；
3. 抗原位于细胞内，未使用穿孔剂 如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗体渗透入细胞内，也 可降解内源性Fc受体； 4. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确 ；
（2）用3% H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗； （3）抗原修复处理，PBS洗； （4）正常山羊血清封闭 15min；
（5）滴加第一抗体，37℃ 孵育1h； （6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗体复合物 37℃，60min； （7）PBS洗（一定要充分），DAB显色； （8）苏木素衬染，脱水、透明、封固。
第十七页，共41页。
附 免疫多染技术
原理 用不同来源的抗体和不同的染色同时检测同一标本中
的多种抗原标记物。
第十八页，共41页。
第十九页，共41页。
第二节 葡萄球菌A蛋白 （SPA） 的应用
第二十页，共41页。
葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A，SPA） 一、特性：
第七页，共41页。
（二）标记生物素-抗生物素技术 （Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）
以生物素标 记抗体作第一抗体， 酶标记抗生物素作 为第二抗体，同SP技术
LAB法示意图
第八页，共41页。
2、操作步骤 （1）①-④ 步骤与ABC法相同 ；
（5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。
第二十五页，共41页。
（二）部分着色
1. 灶片装着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气泡，组织局部鼓起。 2. 阴阳着色：测试片未放平，滴加试剂偏向一侧。
（三）着色部位改变
1. 间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非特异 性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙；抗体不 纯或被污染；
第九页，共41页。
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术：
S-P （ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex）技术
第十页，共41页。
2、操作步骤
（1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ；
⑥ 确定标本的处理及储存条件；
⑦ 检查色原/底物溶液，底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效；
第二十三页，共41页。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不 应含有叠氮钠；
⑨ 检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性树胶， 荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。
第四页，共41页。
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术
1．基本原理
第五页，共41页。
2、操作步骤
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗；
（2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ；
（6） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （7） PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育 20min；
（8） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （9） PBS洗后，DAB/H2Ｏ2显色；
（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ；
（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素 和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ；
第二十二页，共41页。
2、假阴性结果：原因有两种： （1） 染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用H&E染色验证。 （2） 染色中错误： ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等； ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间； ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一 点是非常重要的； ④ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在4~8℃条件 下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效 价； ⑤ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适；
（10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。
第十五页，共41页。
（六） Envision技术
用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体 ， 具有很强的信 号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。
第十六页，共41页。
2、操作步骤 （1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗；
色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能 排除一种可能的原因。一定设对照，主要是阴性对照和阳性 对照。
（一）无信号
染色结果阳性对照/标本均无染色，出现无信号染色现象有两种原因：
1、真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号；或表达抗原太低，所 使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。
（7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。
第六页，共41页。
3、ABC法的优点 （1）敏感性高 :结合力强,分子量小;
（2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ；
（4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多 重免疫染色 。
1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定 ；
2、 能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合； 3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物 。
二、应用
SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物种属限 制。
第二十一页，共41页。
三、常见问题及处理
主要是无信号、信号弱、杂信号等三种。当免疫组化染
5. 切片上遗留了过多的冲洗液，；
6. 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
第二十四页，共41页。
三、杂信号 由于切片、内源性IgG、Fc受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素的存在
等原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生物素暴露，造成染 色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下：
生物素过氧化物酶
第一页，共41页。
亲和的概念
物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、生物 素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白与IgG、
植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结 合反应等。
第二页，共41页。
第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术
一、基本原理
（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素 （Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ；
（6） PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色；
（7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。
第十三页，共41页。
（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法
根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶 性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ，敏感性更高，尤其适合原始信号 较弱的信号检测，但操作较复杂。
第十一页，共41页。
（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
以生物素标记抗体作 第一抗体，抗生物素作为 第二抗体，桥接酶标生物 素。
第十二页，共41页。
2、操作步骤 （1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min；（4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min； （5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min；
第二十七页，共41页。
பைடு நூலகம்
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干 燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水 稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室 温过夜干燥。装盒备用。
（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 。
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二、几种经典的抗生物素－生物素染色法
（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术 （三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）：
第一步
第二步
第三步 第四步
第十四页，共41页。
第五步
2、操作步骤
（1） 常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理；
（2） 3% H2Ｏ2甲醇液15min； （3） 正常封闭血清，室温20min，甩干； （4） 滴加特异性一抗4℃过夜或37℃ 孵育1h； （5） PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃ 30min；
第二十八页，共41页。
2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、 10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟， 主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（一）全片着色 1.是否有效地去除了内源性酶和生物素 ；
2.封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清 ；
3.所选择的抗体是否符合试验要求 ，主要是抗体纯度； 4.一抗的使用浓度是否过高 ；
5.清洗是否充分 ，DBA的使用是否正确 ，边缘效应； 6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 ；
7.组织抗原弥散等。
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响， 极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用防脱片试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸 馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片 捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影 响染色结果。
2. 细胞浆着色 ：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白； 3. 细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡 时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有浸没在修复液中等。
第二十六页，共41页。
四、石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理：
S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
（五）CSA（Catalyzed signal amplification）法
（六） Envision技术
（4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ；
（5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃ 30min ； （7） PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC）， 37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。