初始污染菌检验方法验证方案

初始污染菌检验方法适用性验证方案文件编号：
编制/日期：
审核/日期：
批准/日期：
XXXX有限公司
1.验证目的---------------------------------------------------------3
2.范围-------------------------------------------------------------3
3.验证小组成员及职责-----------------------------------------------3
4.参考资料---------------------------------------------------------3
5.检验仪器及器具---------------------------------------------------3
6.菌种信息---------------------------------------------------------4
7.试验环境---------------------------------------------------------4
8.产品选择---------------------------------------------------------4
9.方法适用性验证---------------------------------------------------4
10.修正系数（校正因子）--------------------------------------------6
11.测试结果--------------------------------------------------------7
12.再验证周期------------------------------------------------------7
13.结论------------------------------------------------------------7
14.附表------------------------------------------------------------8
1.验证目的
证明本公司医疗器械产品初始污染菌洗脱培养计数检验方法的适宜性和准确性。

2.范围
本方案适用于公司原材料及产品进行初始污染菌检测方法的验证。

3.验证小组成员及职责
人员部门职务职责
最终审核、批准验证方案。

负责验证方案的起草、实施，参与方案、报
告的审核、负责验证结论的评价与批准。

验证的执行，实施过程中出现的结果进行分
析，对出现的偏差填写“偏差调查处理表”，
上报。

器具的校验确认，验证的执行，验证过程中
偏差的调查处理。

4.参考资料
WD/ZGTF/GCGC/002初始污染菌检验规程
GB/T19973.1-2015医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物总数的测定
GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准
中国药典四部2020版
5.检验仪器及器具
本次验证所用的仪器信息见下表1。

表1检验仪器列表
仪器名称编号检定/校准有效期
pH计J20-012023.11.9
霉菌培养箱J27-012023.11.9
生化培养箱J59-012023.11.9
电子天平J17-052023.11.9立式高压蒸汽灭菌器J19-012023.11.9
洁净工作台J2-012023.11.9
器具：无菌镊子、无菌剪刀、一次性接种环、无菌移液管、无菌平皿、锥形瓶。

6.菌种信息
验证所用的菌种均购自CMCC，其种类及传代次数符合《中国药典》相关要求。

表2菌种信息列表
菌株名称菌种编号使用菌种的代次金黄色葡萄球菌CMCC（B）260034代
铜绿假单胞菌CMCC（B）101044代
枯草芽孢杆菌CMCC（B）635014代
白色念珠菌CMCC（F）980013代
黑曲霉CMCC（F）980033代
7.试验环境
本次试验在环境洁净度10000级的阳性室内100级的生物安全柜内生物安全柜内进行。

试验环境温度应符合18℃~28℃，相对湿度应符合45%~65%。

微生物限度室、超净工作台、阳性操作室、及生物安全柜的工作台面应定期按照本公司文件进行悬浮粒子、沉降菌和换气次数的监测。

8.产品的选择
根据GB/T19973.1-2015要求，需选择能代表产品材质的相关组件或部位进行验证，故本次验证选取其中最有代表性的产品进行初始污染菌方法学验证及回收率的确认。

表3产品信息列表
产品名称管理类别主要组件
根据表1所述信息，本公司产品医用防护口罩组件涵盖所有产品材料类别，产品使用时与人体面部接触时间长，因此选择医用防护口罩作为本次验证的样品。

9.方法适用性验证
9.1菌液制备
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌斜面管，30~35℃培养18-24小
时。

取白色念珠菌斜面管，20~25℃培养2~3天。

取黑曲霉斜面管。

20-25℃培养5~7天。

配制0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释液，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌斜面管，无菌操作，加入3-5ml稀释液制成菌悬液，采用划线接种法，接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，30~35℃培养18-24小时得到新鲜培养物。

取白色念珠菌斜面管，无菌操作，加入3-5ml稀释液制成菌悬液，采用划线接种法，接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，20~25℃培养2~3天得到新鲜培养物。

取黑曲霉斜面管，无菌操作，加入3-5ml稀释液制成菌悬液，采用划线接种法，接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，20~25℃培养5~7天得到新鲜培养物。

9.1.1稀释菌悬液
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌新鲜培养物培养基中加入10ml稀释液、晃匀、吸取1ml,采用10倍逐级稀释法稀释至10-6、10-7菌悬液，黑曲霉新鲜培养物中加入4ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后使用灭菌移液管吸出孢子悬液至无菌试管内，在吸取1ml，采用10倍逐级稀释法，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释至10-6、10-7菌悬液，得出＜100cfu/ml的菌悬液。

9.2试验方法
9.2.1供试液制备
在洁净度100级工作台上，以无菌操作的方式从医用防护口罩剪取10g投入装有100ml无菌生理盐水的三角瓶内，浸泡、手动振摇80次，制成1:10的供试液。

9.2.2试验组
分别准确吸取上述制备好的1ml菌悬液，分别注入装有100ml供试液的无菌三角瓶中，充分混匀，采用平皿法，每种菌平行制备2皿，取lml供试液，置入直径90mm 的无菌平皿中，接种细菌的平皿中加入温度不超过45℃TSA培养基，混匀，凝固后倒放培养箱内30~35℃培养3天，接种真菌的平皿中加入温度不超过45℃TSA和SDA培养基，混匀，凝固后倒放培养箱内20~25℃培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

9.2.3供试品对照组
取制备好的供试液1ml，不加菌，置入直径90mm的无菌平皿中，再往平皿内加入
15~20mlTSA培养基与SDA培养基，TSA培养30~35℃，SDA培养20~25℃。

9.2.4菌液对照组
取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液分装于无菌试管中，每管9.9ml，分别向试管中加人制备好的小于100cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌试验菌液0.1ml，混匀后取lml采用平皿法，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，每种试验菌株平行制备2皿，混均，凝固，置30~35℃培养3天，白色念珠菌、黑曲霉同上述方法置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基和胰酪大豆胨琼脂培养基，混均，凝固，置20~25℃培养5~7天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

9.2.5阴性对照组
为了检查稀释液及培养基的无菌性，并且对无菌操作过程进行全面控制，以确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验用稀释液代替供试液和菌液，与试验组同法操作，阴性对照试验应无菌生长。

9.3测试结果
相关结果见附表1。

9.4结果判定
阴性对照组应无菌生长，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内。

0.5≤试验组菌落数-供试品对照组菌落数/菌落对照组菌落数≤2.0
10.修正系数（校正因子）
10.1试验方法
向单个样品中加入适量浸提液，充分震摇后收集于一已灭菌容器中，即得第一次洗脱液。

同法洗脱第二次、第三次、第四次。

采用薄膜过滤法，每张滤膜过滤适量供试液，用适量浸提介质冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于培养基上，如此反复四次。

然后用每个样品分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各1个；另取浸提介100mL同法操作，作为阴性对照。

以上两种培养基分别于35℃和25℃培养培养5天。

10.2结果计算
第1次洗脱的回收率=第1次洗脱菌数÷总菌落数*100
第1次洗脱的平均回收率=(样品1第1次洗脱菌数+样品2第1次洗脱菌数+样品3第1次洗脱菌数)/3
修正系数(校正因子)＝100/(第1次洗脱的平均回收率*100)
若发现回收率低于70%，宜考虑技术改进或使用替代技术。

11.测试结果
相关结果表见附录1，附录2。

12.再验证周期
原辅材料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。

国家相关初始污染菌检测标准内容修改后需要对本方法重新进行再验证。

13.结论
评价内容结果评价备注验证结果是否有遗漏□是，☑否
验证实施过程中对确认方案有无修改□有，☑无
验证方案修改原因、依据、是否经过批准□经过，□未经过无修改验证记录是否完整☑完整，□不完整
验证结果是否符合标准要求☑符合，□不符合
结论：本次验证的验证项目符合方案规定，验证程序合理，验证数据可靠，验证文件可行，验证的数据结果均符合规定标准，证明在检验初始污染菌时采用该种检验方法能够符合其检验及标准的要求。

批准人：
初始污染菌方法适用性试验记录
产品名称生产批号
生产日期检验日期
检验依据中国药典四部2020版
标准要求0.5≤试验组菌落数-供试品对照组菌落数/菌落对照组菌落数≤2.0
细菌菌落计数
培养温度：培养时间：
菌株金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌试验组
菌液对照组
供试品对照组
阴性对照
计算结果
霉菌、酵母菌菌落计数
TSA培养温度：培养时间：
SDA培养温度：培养时间：
菌株白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌黑曲霉培养基胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基
试验组
菌液对照组
供试品对照组
阴性对照
计算结果
结论：采用平皿法试验，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值结果均在0.5～2范围内，符合中国药典四部2020版1105要求。

检验人/日期
复核人/日期
校准因子检验记录
产品名称生产批号生产日期检验日期
检验依据
GB/T19973.1-2015附录C
处理步骤
样品1
样品2
样品3
细菌
霉菌和酵母菌（cfu）
细菌
霉菌和酵
母菌（cfu）
细菌
霉菌和酵
母菌（cfu）
第一次洗脱第二次洗脱第三次洗脱第四次洗脱琼脂覆盖总菌落数第一次处理的回
收率第一次处理的平均回收率
细菌：霉菌和酵母菌：修正系数
（校准因子）细菌：霉菌和酵母菌：
阴性对照
结论：采用薄膜过滤法试验，细菌、霉菌和酵母菌平均回收率均高于70%，试验结果符合本方案10.2的要求。

检验人/日期复核人/日期。