乙肝病毒检测的方法学评价

患者血清中存在三种基本形态
• 大球型颗粒，又称Dane颗粒；小球型颗 粒；管型颗粒
• 小球型颗粒；管型颗粒 • 管型颗粒
乙型肝炎病毒的实验室诊断
• （一）血清学检查
（二）生化学检查 （三）HBV DNA、基因型和变异检查
血清学检查
• 项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM
2.乙肝表面抗体（抗-HBs）定量测定：
• 是HBsAg刺激机体产生的特异性抗体，是一种保护性 抗体，能中和HBV。
• （1）抗-HBs含量在0-10mIU/ml，表示不具有保护性， 需要注射乙肝疫苗（3针：0-1-6方案）。
• （2）抗-HBs含量在10-100mIU/ml，表示具有保护 性，但较弱，需要乙肝疫苗强化注射（1针）。
主要用于监测治疗反应
HBV血清学标志物的临床意义
感染模式 HBsAg HBeAg HBc(IgM) 抗
抗HBe 抗HBs 临床意义
HBc(IgG)
1
+
-
-
2
+
+
-
-
-
-
急性乙肝潜伏期后期， 携带者。
-
-
-
急性乙肝早期或潜伏期
3
+
+
+
-
-
-
急性乙肝早期
4
+
+-
+
+
-
-
急性乙肝后期
5
+
+-
+-
-
-
-
急性或慢性乙肝，有 HBV复制
• 5、乙肝病毒核心抗体（抗-HBc）
• 抗-HBc：不是中和抗体，有IgG和IgM 两种形式。IgM在早期出现，而IgG在 恢复期出现，可持续多年或终身存在。
乙肝五项定量检测的优点
• 由于乙肝病毒容易发生变异，再加上乙肝定性 检测方法的局限性，会出现假阴性结果，导致 不能及时发现乙肝的感染，也就不能得到及时 的治疗，对医护人员和其他患者也存在着被感 染的威胁。
• 乙肝三系定性检查是用来判断是否感染 乙肝或粗略估计病毒复制水平的初步检
查，对患者病情程度的评估参考性不大，
所以乙肝患者在做乙肝三系定性检查的
时候，应结合肝功能检查、乙肝病毒 DNA检查、B超检查等来判定病情的轻 重，
ELISA检测灵敏低的原因及局限
• ELISA法受其自身敏感性和特异性的限制; • HBV S和前C基因区出现位点突变导致HBsAg和
HBV基 因 及 编 码 蛋 白
HBV-DNA定量检测的临床应用
• 慢性乙肝诊断 • 治疗监测和疗效评价 • 跟踪随访 • 预后判断
（二） HBV-DNA与“两对半”
• 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
• FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质— DNA，是
•
病毒存在和复制的最可靠、最直接
•
（S区变异）
•
③ 低水平感染
•
单项抗HBc(﹢)乙型肝炎
• ⒉ 疗效判断： • HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药
物疗效最敏感的指标
• ⒊ 预后判断 • HBV DNA水平与病情有一定的关系
•
一、乙肝病毒DNA检查可检查乙肝病毒
的复制状况。如乙肝病毒DNA测定值
>1000copies/ml，就提示乙肝病毒有复制，而
乙肝病毒检测
——方法学评价
乙肝病毒结构
（一） 乙型肝炎病毒结构特点
HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体
HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
PCR技术在乙肝方面的应用
• 乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科 （hepadnaviridae），基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 部分双链环状DNA。
定量PCR的特点
• 可定量结果，准确灵敏地反应了病原体 的感染和治疗恢复情况
• 光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强 了灵敏性和客观性。
慢性乙肝一些患者由于机体常缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答， HBsAg表达较低，酶标检测可出现HBsAg和HBsAb均阴性的情况， 而定量检测则可避免这些情况的出现，为正确判断病情提供依据。
灵敏度如病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而 定量检测具有极高的灵敏度，可发现极有可能同时检测出HBsAg和 HBsAb，血清中HBsAg含量与病人对HBsAg细胞免疫成反比关系， 而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。定量HBsAg是反映这一关 系的唯一手段。可发现低浓度的HBsAg携带者，特别是一些群体如 医务工作者及病人家属等。
果解释。
HBV-DNA检测的临床意义
• ⒈ 诊断方面：
• ⑴ HBV DNA是HBV存在最直接的依据
• ⑵ HBV DNA是HBV复制的标志
• ⑶ HBV DNA是患者具有传染性的标志
• ⑷ 对HBV-M起补充作用：
•
① HBeAg(﹣)/ 抗HBe(﹢)乙型肝炎
•
（前C区变异）
•
② HBsAg(﹣)乙型肝炎
免了交叉污染,实现了对HBV DNA 的定量测定, 其实 时监测技术使药物选择和疗效观察成为可能; • 漏检率低。
药物治疗
（疗效评价）
跟踪随访
乙肝病毒分型检测
前C区1896位点突变检测
拉米夫定耐药检测 阿德福韦耐药检测 恩替卡韦耐药检测
共价闭合环状DNA (cccDNA)检测
FQ-PCR检测的优势
• 灵敏度高可以达到 pg 级而 ELISA 只能检测 ng级， 可以检测包括乳汁的其他低含量的标本;
• 不受病毒变异影响，而前C和S变异后ELISA难以检测; • 荧光定量PCR 技术采用闭管检测, 无须凝胶电泳, 避
• 方法
– ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性)
• HBsAg – 感染的标志 • Anti-HBs – 既往感染/接种疫苗 • Anti-HBc IgM – 急性感染标志 • Anti-HBc IgG – 既往或慢性感染 • HBeAg – 急性病毒复制，有传染性 • Anti-HBe –病毒不再复制 • HBV-DNA – 急性病毒复制，比HBeAg更准确；
的指标。
• 2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免 疫学指标不能
• 反应体内病毒复制水平与感染程度。
3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。 4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-
DNA(－)。 • 5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、
HBeAb (＋)三抗体阳性 • 与HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 结
HBeAg表达缺陷。 • 影响因素多,如加样时间,试剂平衡时间,样本
溶血程度等等。特别是低浓度样本易导致假阴 性结果,使弱阳性样本漏检。 • 急性感染的窗口期; HBsAg检测方法灵敏度不 足;血清亚型的漏检等。 • 标本中病毒颗粒少;
血清学检测的局限性
• HBV具有“检测窗口期 • 假阴性结果 • 无法检测突变株及抗体
6
+
+
+-
+-
+
-
急性或慢性乙肝。急性 期或无症状携带者
7
+
-
+-
+
+
-
阴性慢性乙肝
8
+
-
-
-
+
-
慢性乙肝，无或低度 HBV复制，乙肝恢复期，
既往感染，隐匿性
9
-
-
-
恢复期，既往感染， 隐匿性
10
-
-
-
-
-
+
慢性乙肝，接种过乙肝 疫苗。
两对半的意义
• — 乙型肝炎的诊断 • — 判断传染性 • — 判断预后 • — 筛查献血员 • — 流行病学调查
乙肝病毒的定量检测
• 1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量检测：
• 1）参考值：0-0.05IU/mL • 2）临床意义： • （1）可作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标 • （2）评价拉美呋定的治疗效果 • （3）监测应用alpha-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制 • （4）确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量
•
四、乙肝病毒DNA检查结果还可以在一
定程度上辅助判断乙肝病毒是否产生了变异，
如在治疗过程中乙肝病毒DNA检测结果由阴
性转为阳性时，则提示病毒已发生变异，应结
合具体病情重新选择抗病毒药物。
基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用
乙 肝 病 毒 定 量检测
确 病毒学 药物治疗方案的确定
诊
分析
（用药：干扰素、拉米夫定、 阿德福韦、恩替卡韦）
• （3）抗-HBs含量大于100mIU/ml，表示具有很强的 保护性，不需要注射乙肝疫苗。
• 3、乙肝病毒e抗原（HBeAg） • HBeAg增高说明病毒复制，具有很强的
传染性。
• 4、乙肝病毒e抗体（抗-HBe） • 抗-HBe阳性说明病毒复制减少，传染性
弱，但并非没有传染性。抗HBe不是保 护性抗体 。
且病毒数量的高低与病毒复制的程度成正相关。
若结果阴性，则表明病毒处于不活跃阶段，病
情比较平稳。
•
二、乙肝病毒DNA检查还是判断乙肝病
毒传染性的重要指标。如果乙肝病毒DNA测
定值>1000copies/ml，常提示具有传染性，且
检测值越高就说明乙肝病毒复制越活跃，传染
性越强。
• 三、乙肝病毒DNA检查可以作为肝病患者确 诊病情的主要依据。乙肝病毒DNA阳性者， 即使肝功能正常，必要时也应考虑进行抗病毒 治疗。乙肝抗病毒治疗的标准就是乙肝病毒 DNA>1000copies/ml，且患者转氨酶超过正 常值两倍，此时是肝病患者抗病毒治疗的最佳 时机。
定量检测意义
监测疾病发展 评估药物疗效 指导疫苗接种
国内疫苗评价标准
无应答者:无抗体产生 (5%) ---- 加强计量复种 低应答者:<10 IU/L (10%) ---- 加强计量复种 中应答者:10-100 IU/L (65%) ---- 无须复种 高应答者:>100 IU/L (20%) ---- 无须复种
• 乙肝五项定量应用目前最先进的化学发光法检 测，避免了假阴性和漏检的问题，而且准确， 尤其对乙肝病人的疗效观察提供了依据，这是 检验发展的趋势。
两对半定量检测极大地提高了检测的灵敏度，LiCa技术检测HBsAg灵 敏度可达0．5ng/ml，而ELISA检测HBsAg达到2ng/ml时才会阳性。
急性乙肝早期定量能及早检出HBsAg，确证HBV感染，几乎能与PreSi 同时检测，在病程观察中大大缩短了“窗口期”，而酶标检测在乙 肝早期往往HBsAg呈阴性。