ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究

ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌

产纤维素酶的研究

陈利娟;吴斌;何冰芳

【摘要】旨在选育鼠李糖脂高产菌株，以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosaC3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变（ARTP），选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosaSC-11，产量比出发菌株提高

了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化，优化

后的鼠李糖脂产量达42 g/L，底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖

脂到Bacillus subtilisCL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中，羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明，鼠李糖脂通过增加细胞

通透性来提高胞外酶产量。%In order to obtain an industrial strain with higher rhamnolipid production, the original strain ofPseudomonas aeruginosaC3 was mutated by atmospheric and room temperature plasmas. A good genetic stability strain SC-11 was screened from the mutants, which produced rhamnolipid 74.1% higher than that by the original strain. Through single factor experiments, the culture medium for rhamnolipid production was opttimized. The yield of rhamnolipid could reach 42 g/L and the substrate conversion rate is 0.7 g/g substrates. 0.01% rhamnolipid could enhance CMCase by 12.9% and xylanase by 18.3%. The results show that rhamnolipid increased the production of cellulase by increasing cell permeability.

【期刊名称】《生物技术通报》

【年(卷),期】2015(000)011

【总页数】7页(P195-201)

【关键词】常压室温等离子体诱变;鼠李糖脂;羧甲基纤维素酶;木聚糖酶

【作者】陈利娟;吴斌;何冰芳

【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816;南京工业大学生

物与制药工程学院，南京 211816;南京工业大学生物与制药工程学院，南京211816

【正文语种】中文

生物表面活性剂是一种由微生物合成的、结构多样的表面活性物质，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂及中性类脂衍生物等［1］。目前，研究最广泛的生物表面活性剂是糖脂，其中对由铜绿假单胞菌产的鼠李糖脂研究最多［2］。鼠李糖脂具有乳化、增溶及降低界面张力等功能，在生物能源、石油化工、生物医药及食品等领域有较大应用前景［3-7］。目前较低的产量和过高的生产成本限制了鼠李糖脂在工业上广泛应用，因此获得一株高产菌株，对于鼠李糖脂工业化生产至关重要。常压室温等离子体诱变是一种新型的育种技术，该技术可以快速高效地突变各类微生物，已成为获取高产菌株的有效方法［8］。

本研究对本实验室筛选并保存的产鼠李糖脂菌株Pseudomonas aeruginosa C3

进行常压室温等离子体诱变，筛选出一株遗传性状稳定的高产菌株，并通过单因素实验进一步对产脂培养基和发酵条件进行优化，最后研究产物鼠李糖脂对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响，旨在选育鼠李糖脂高产菌株。

1.1 材料

1.1.1 菌株及试剂菌种铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa C3），枯草芽

孢杆菌（Bacillus subtilis CL）由本实验室分离筛选获得；酵母粉、蛋白胨购自英国Oxoid公司，苔黑酚购自美国 Aladdin公司，其他试剂均为化学纯采购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 培养基筛选培养基：蓝色凝胶琼脂平板（%）［9］：葡萄糖 2，

KH2PO40.07，Na2HPO40.09，NaNO30.2，MgSO4·7H2O 0.04，

CaCl2·2H2O 0.01，CTAB 0.02，亚甲基蓝 0.000 5，琼脂 1.5，2 mL/L 微量元素溶液。微量元素溶液（%）：FeSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.15。

初始发酵培养基（%）：甘油 1，NaNO30.5，KH2PO40.1，Na2HPO4·12H2O 0.1，MgSO40.01，FeSO4·7H2O 0.02，CaCl2·2H2O 0.01，pH6.0。产酶培养基（%）：乳糖1，K2HPO40.3，MgSO4·7H2O 0.03，蛋白胨1.5，玉米浆粉1.5，初始 pH 值 5.0-5. 5。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂含量检测方法采用苔黑酚法测定鼠李糖脂含量［10］。鼠李糖脂的鼠李糖基在浓硫酸作用下脱水形成糠醛类化合物，与地衣酚结合显示蓝绿色，在421 nm有最大吸收。根据鼠李糖标准曲线得到鼠李糖的浓度，鼠李糖脂的浓度为鼠李糖的3.4倍［11］。

1.2.2 ARTP诱变方法按照ARTP生物诱变育种机的操作流程。以氦气为气体，通气流量为10 L/min，作用距离2 mm，作用功率120 W［12］。将培养好铜绿假单胞菌C3的种子用0.9%的生理盐水稀至OD660=0.6，取10 μL菌液均匀涂布于无菌小铁片上，风干后放入育种机中进行诱变。为了寻找最佳诱变条件，设定处理时间（30、60、90和120 s），将处理后的样品稀释涂布平板，通过平板菌落计数以未处理样品为对照计算致死率。

1.2.3 突变株筛选方法采用蓝色凝胶平板筛选法进行初筛。平板中的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、亚甲基蓝与阴离子表面活性剂鼠李糖脂发生络合作用，便形