实验五、动物细胞DNA的提取与鉴定

DNA酚抽提法示意图
主要试剂的作用：
EDTA：（乙二胺四乙酸）
EDTA起两个作用：（1）鳌合细胞膜和骨架上的Ca2＋、Mg2＋ ，从而使细胞
更易破碎；（2）鳌合Mg2＋ 使得内源性DNase没有Mg2＋ 不能发挥作用，保持DA
的稳定性，Tris起缓冲pH值的作用
SDS ：十二烷基硫酸钠
SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）破坏细胞膜及核膜；（2）解聚细 胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；（4）抑制DNA酶 活性，使DNA分子尽量完整地分离出来
蛋白酶K：
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。
苯酚：蛋白质强变性剂
主要用于DNA提取时蛋白的去除，抑制DNA酶活性；
苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；
提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的 损失率； 氧化苯酚会破坏DNA。
氯仿：异戊醇（23：1）：
主要用于DNA或者RNA提取时蛋白的去除； DNA提取时候，氯仿起变性蛋白质和将第一次抽提后的水相中的 酚带走的作用。异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中 的泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，增加界面的稳定性。
实验五 动物细胞DNA的 抽取与鉴定
指导：刘满清
一 实验目的
了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和常用 方法； 掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理和方法， 增强实验室安全意识。
二 实验原理
动物DNA的提取是分子遗传学的基本操作。DNA提取的 基本程序包括细胞破碎、蛋白质变性并去除、沉淀DNA 并去除其他杂质3步；
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取 方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其 细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异;
本实验介绍用酚抽提法提取血液基因组DNA。
酚抽提法：
先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白， 然后用pH8.0的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最 后乙醇或异丙醇进行沉淀 。获DNA大小为100－ 150kb。
冰无水乙醇：
可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，
可以减少DNA沉淀析出洗涤DNA的作用，主要去盐和有机杂质。
三、实验仪器和试剂
主要的试验仪器：
主要的试剂及配制
DNA提取液SET：
10mmol/LTris·Cl(pH8.0),100mmol/LEDTA,500mmol/L NaCl, 20% SDS；
琼脂糖凝胶电泳
全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
DNA降解电泳结果
五、作业
1、思考在整个基因组提取过程中，为什么要缓慢操 作?这与DNA本身的性质有什么联系？ 2、对所得实验结果进行合理分析。
TE缓冲液(pH8.0) ：
100mmol/LTris·Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0), 室温保存；
氯仿-异戊醇（23：1）：体积23:1 其它试剂：Tris饱和酚（购买）、无水乙醇、75%乙醇，琼脂糖粉。
四、实验方法与步骤
1.30-40ul血液+470ulSET+12.5ul20%SDS+6ul蛋白酶K 摇匀，55℃水浴过夜（按顺序加）； 2.加苯酚500ul,10min摇匀,离心10000r/min 10min； 3.抽上清，加500ul氯仿异戊醇（23：1）,20min摇匀,离心 10000r/min 10min；(重复1次） 4.抽上清,加无水乙醇（冰冻）1000ul,摇匀，冷冻于-20℃ （20分钟以上），离心10000r/min 2min； 5.弃上清，75%乙醇1000ul，离心10000r/min 2min； 6.弃上清，55℃烘干，加TE300ul溶解DNA沉淀或（加300ul 去离子水，溶解后电泳），4℃保存或电泳。 冷冻20min-2h，烘干30min左右，TE(可换做的ddH2O)