高中生物第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序第1课时获取目的基因与构建基因表达载体课件新人教版

(1)模板:均需要脱氧核苷酸单链作为模板
(2)原料:均为4种脱氧核苷酸
(3)酶:均需DNA聚合酶
(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的
合成
2种引物的作用
【视角应用】
1.(2021山东聊城高二期中)下列有关PCR技术的叙述,错误的是( B ) A.PCR技术的原理是DNA半保留复制 B.变性过程中破坏的是磷酸二酯键 C.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 D.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等,无须添加ATP
(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图),请 分别说明理由。
提示 第1组的引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组中引 物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)如果PCR循环n次,则共需消耗多少对引物? 提示 共需消耗2n-1对引物。
【方法突破】
旁栏边角想一想 用PCR技术可以扩增mRNA吗? 提示 mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
结论语句辨一辨 1.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。
( ×) 2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( √ ) 3.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。( × ) 4.PCR过程中需要模板DNA和一个引物分子。( × )
3.下图1、2分别表示载体和目的基因及其上的限制酶的切割位点。
(1)据图分析,构建基因表达载体时,能否用限制酶SmaⅠ切割质粒?为什么? 提示 不能。因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标 记基因,便于重组DNA分子的筛选,若被破坏,无法进一步筛选。 (2)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质 粒、外源DNA的优点是什么? 提示 可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连 接。
第三章
第2节 基因工程的基本操作程序 第1课时 获取目的基因与构建基因表达载体
内
01 基础落实•必备知识全过关
容
索
02 重难探究•能力素养全提升
引
课程标准
1.运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理。 2.基于细胞内DNA复制的原理,阐明PCR的原理,说出PCR所 需的条件及其反应过程。 3.结合模式图说出基因表达载体的组成,并理解构建目的。
【视角应用】
1.(2021江苏扬州中学高二月考)下面是利用基因工程技术培育转基因植物, 进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、 ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( B )
A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析 图示过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项 正确;构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制 酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ,B项错误;抗卡那霉素基因是标记基因,目的是便于鉴定 和筛选含有目的基因的细胞,C项正确;基因表达载体应包括启动子、目的 基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。
主题二 基因表达载体的构建
【情境探究】
构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。目的是让基因在受体细胞中 稳定存在,并且遗传给下一代;同时,使目的基因能够表达和发挥作用。请 讨论回答下列问题。 1.通过PCR技术获取足够量的目的基因后,能直接导入受体细胞吗?为什么? 提示 不能。若将目的基因直接导入受体细胞,目的基因可能被受体细胞分 解或无法随细胞分裂进行复制,不能稳定遗传和表达。 2.作为基因表达载体,需要包含哪些功能原件?启动子、终止子和起止密码 子和终止密码子的化学本质是否相同? 提示 基因工程表达载体需要包含目的基因、标记基因、启动子、终止子 等功能原件。启动子和终止子位于DNA上,是DNA上的碱基序列;起止密 码子和终止密码子是mRNA上的碱基序列。
基础落实•必备知识全过关
知识点一 目的基因的筛选与获取
1.培育转基因抗虫棉的四个步骤 目的基因的筛__选__与__获__取__→___基__因__表__达__载__体_______的构建→将目的基因导 入_受__体__细__胞___→目的基因的检__测__与__鉴__定__。 2.筛选合适的目的基因 (1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 (2)应用测序技术、序列数据库、序列比对工具等认知更多的基因结构和 功能,以便找到合适的目的基因。
A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入 B.复性温度过高会导致引物不能与模板链牢固结合,PCR扩增效率下降 C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
解析 引物中设计两种限制酶识别位点,可以配合载体的限制酶识别位点, 帮助目的基因定向定点插入载体,避免发生自身环化,A项正确;PCR技术中, 复性是指引物结合到互补DNA链,复性温度过高会引起碱基之间的氢键断 裂,导致引物不能与互补DNA链(模板链)牢固结合,DNA扩增效率下降,B项 正确;第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因,C 项正确;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA只有1个,而 子代DNA有23=8(个),故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8,D项错误。
聚合酶链式反应
3.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的目的:在体外对目的基因的核酸序列进行大量复制。 (2)PCR原理:__D__N_A__半__保__留__复__制_____。 (3)PCR条件:一定的缓冲溶液、_D__N_A__模__板__、分别与两条模板链结合的2 种引物、4种脱氧核苷酸和__耐__高__温_的__D__N_A__聚__合____酶。
解析 构建重组质粒时,要将目的基因插入到启动子和终止子之间,而且不 能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位,故只能选用 NdeⅠ和BamHⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段,因此在PCR扩增的该 基因的两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。
考题点睛
细胞内DNA复制与PCR技术的比较
比较项目 解旋 方式
细胞内DNA复制 解旋酶催化
PCR技术 DNA在高温下变性解聚
区 场所 别酶
温度 结果
联系
主要在细胞核内
PCR扩增仪(PCR仪)内温和条件
控制温度,在不同温度下进行
合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
知识点二 基因表达载体的构建 1.基因表达载体的构建目的 使目的基因在受体细胞中_稳__定__存__在___,并且可以遗传给下一代,同时,使目 的基因能够___表__达_____和_发__挥__作__用___。 2.基因表达载体的组成
启动子 终止子
标记
上游 RNA聚合酶
转录 下游
转录
目的基因
3.基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的__限__制__酶____切割载体。 (2)然后用___同__种_____限制酶或能产生_相__同__末__端___的限制酶切割含有目的 基因的DNA片段。 (3)再利用D__N_A__连__接__酶_将目的基因片段拼接到载体的切口处。 旁栏边角想一想 将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗?如果这么做,效果会 怎样? 提示 采用总DNA注射法进行遗传转化,即将一个生物的总DNA提取出来, 不进行基因表达载体的构建,通过注射等方法导入受体植物。这种方法针 对性差,无法确定哪些基因导入了受体植物。
解析 PCR技术根据DNA半保留复制的原理,将基因的核苷酸序列不断地加 以复制,使其数量呈指数增加,A项正确;变性过程中目的基因DNA受热变 性后解链为单链,破坏的是氢键,B项错误;引物是一段目的基因已知的核苷 酸序列,复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完 成的,C项正确;延伸过程中需要模板DNA、四种dNTP、耐高温的DNA聚 合酶等,无须添加ATP,D项正确。
【方法突破】
1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子:启动子和终止子位于 DNA上,是基因表达载体必需的部分,而起始密码子和终止密码子位于 mRNA上,决定翻译的开始和结束。
2.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SamⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:所选择的限制酶尽量 不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶切 割质粒,如图中PstⅠ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使 用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种 限制酶。
2.(2021山东枣庄高二期中)如图所示为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不 含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒, 则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列?( A ) 注:图中不同限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。
A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠ C.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ
分别与两条模板链结合,使DNA聚合酶能够从引物的3 '端开始 连接脱氧核苷酸
(4)每次循环的过程:变性→复性→延伸。 ①变性:当温度超过90 ℃时,_双__链__D__N_A_解__聚__为__单__链___。
打开DNA双链 ②复性:冷却至____5_0_____ ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条 单链DNA结合。 ③延伸:加热至72 ℃左右时,4种脱氧核苷酸在耐高温的_D__N_A_聚__合__酶___的作 用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)特点:上一轮循环的产物作为下一轮反应的___模__板_____,每一次循环后, 目的基因的量可以_增__加__一__倍___,即成指数形式扩增(约为2n,n为扩增循环的 次数)。 (6)鉴定:常用___琼__脂__糖__凝__胶__电__泳_____来鉴定PCR的产物。
重难探究•能力素养全提升
主题一 目的基因的筛选与获取
【情境探究】
在基因工程中,目的基因是用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等 的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因。请结合教材“目的基因的 筛选与获取”相关内容,回答下列问题。 1.获取目的基因的方法有哪些? 提示 人工合成目的基因;用PCR特异性地快速扩增目的基因。 (1)PCR反应需要与两条模板链结合的引物,什么是引物? 提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
2.(2021山东师大附中高二期中)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的 基因的定点诱变。如图为获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一 个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反 应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。 下列有关叙述错误的是( D )
结论语句辨一辨 1.表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。( × ) 2.外源DNA必须位于重组质粒的启动子上游或终止子的下游才能进行表 达。( × ) 3.基因表达载体中需要含有起始密码、终止密码、目的基因、标记基因。
( ×) 4.借助抗生素抗性基因可将含目的基因的受体细胞筛选出来。( √ )