鸡肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制研究_黄明

第23卷第11期2007年11月农业工程学报
T ra nsactio ns o f the CS AE V o l.23　N o.11N ov.　2007
鸡肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制研究
黄　明1,赵　莲1,徐幸莲1,汤晓艳2,周光宏1※
(1.南京农业大学,教育部肉品加工与质量控制重点开放实验室,南京210095;
2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081)
摘　要:为了探讨肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制,五只肉鸡分别宰杀后,迅速取出胸肉约3g 为0d 样品,其余肉样剪碎后随机分成六组,一组作为对照,另5组分别用30mmo l /L EG T A 、20mmo l /L CaCl 2、酶复合抑制剂、100μmo l /L 细胞凋亡酶3抑制剂(DEV D-CHO )、20mmo l /L Ca Cl 2和酶复合抑制剂处理,在4℃成熟1、3、7d 后取样。

通过SDS-PA GE 和蛋白质印迹分析测定了骨骼肌中和肉嫩度高度相关的拌肌球蛋白(titin )、伴肌动蛋白(nebulin )、肌间线蛋白(desmin )、肌钙蛋白T (tro po nin -T )的降解变化。

结果显示蛋白水解酶复合抑制剂和D EV D -CHO 抑制了蛋白的降解,单独的钙离子加速蛋白降解。

这表明肉的成熟是内源酶的作用,钙离子很可能通过激活钙激活酶发挥作用,另外细胞凋亡酶3也很可能参与了肉的成熟。

关键词:鸡肉;肌原纤维蛋白;降解机制;成熟;细胞凋亡酶3;钙离子
中图分类号:T S251.5+2 文献标识码:A 文章编号:1002-6819(2007)11-0042-05
黄　明,赵　莲,徐幸莲,等.鸡肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制研究[J].农业工程学报,2007,23(11):42-46.Hua ng M ing ,Zhao Lia n ,Xu Xinglia n ,et al .M echa nism of my ofibrilla r pr oteins deg radatio n during chicken postmo r tem aging [J].T ra nsactio ns o f the CSA E,2007,23(11):42-46.(in Chinese with Eng lish abstract)
收稿日期:2007-01-27　修订日期:2007-11-04
基金项目:国家自然科学基金(30371016);国家“973”计划(2006CB708212)
作者简介:黄　明(1970-),男,河南商丘市人,博士,中国畜产品加工研究会常务理事,主要从事肉品质量控制研究。

南京卫岗　南京农业大学食品科技学院,210095。

Email :mh uang @ ※通讯作者:周光宏,教授,博士生导师,中国畜产品加工研究会会长。

南京卫岗　南京农业大学食品科技学院,210095。

Email :gh z h ou @
0　引　言
嫩度是决定肉食用品质最重要的指标,肉类动物在宰后一段时间内,由于尸僵的发生,嫩度会降低,而在随后低温(0～4℃)贮藏过程中嫩度风味等逐步得到改善,这一过程被称为成熟。

研究发现动物的种类、年龄、部位、宰前管理对成熟的速度和进程都有影响,并造成最终肉的嫩度极不均一。

为了改善肉的嫩度很多学者对肉的成熟机理进行了研究,目前已证实肉在成熟过程中嫩度的改善主要归因于肌肉肌原纤维蛋白的降解
[1-3]
,但
在这些蛋白的降解机理上仍存在较大分歧。

Takahashi 等[1]认为成熟主要是钙离子的作用,Koohmaraie 等[2]
认为是钙激活酶的作用,另外的学者则认为是多种酶的协同作用[3]。

到目前为止,在肉中发现的可能参与蛋白水解的酶类主要包括钙激活酶类、溶酶体组织蛋白酶类、蛋白酶体和细胞凋亡相关的Caspase 酶[4]。

而有关细胞凋亡酶在肉成熟中的作用国内外还鲜见报道。

本研
究的主要目的就是通过对内源酶抑制或激活处理,探讨内源酶在肉成熟中的作用,证实细胞凋亡酶3是否参与了肉的成熟,从而为进一步阐明肉的成熟机理提供了新的实验依据。

1　材料与方法
1.1　实验材料1.1.1　试剂
蛋白酶复合抑制剂(pro tease inhibito r cocktail)购自Roche 公司;细胞凋亡酶3(caspase3)抑制剂(DEV D-C HO )购自Bio mol 公司;硝酸纤维素膜购自Bio -Rad 公司;兔抗鸡骨骼肌desmin 抗体为日本北海道大学肉类实验室自制;过氧化物标记羊抗兔免疫球蛋白抗体购自Chemico n 公司;蛋白浓度测定试剂盒(BC A pro tein as-say kit )购自Pierce 公司;化学发光检测试剂(ECL w estern blo tting detection reag ents )和感光胶片(Hy-per-film )购自Am ersham 公司;其它试剂皆为分析纯。

1.1.2　仪器
电泳和印迹转运系统(Mini -Pro tean II system )为Bio-Rad 公司生产;高速冷冻离心机为日本日立公司生产(SCR20BC)。

1.2　实验方法1.2.1　鸡肉样品制备
5只罗丝肉鸡(来自北海道大学农学实验场)宰杀
42
后,迅速取出胸肉约3g 用液氮冷冻后放于-80℃冰箱作为0d 样品,其余肉样剪碎后随机分成六组,一组按肉液1∶1(w /v )将肉浸泡于含100m mol /L NaCl 、2m mol /L NaN 3溶液(对照组),另五组和对照组同样处理,但分别在浸泡液中添加了30mmo l /L EGTA 、20m mol /L Ca Cl 2、酶复合抑制剂、100μmol /L 细胞凋亡酶3抑制剂(DEVD-CHO)　20mmol /L Ca Cl 2和酶复合抑制剂。

样品在4℃成熟1、3、7d 后取样。

1.2.2　肌原纤维纯化与电泳样品制备
肌原纤维的提取和纯化采用Etling er 的方法[5]。

将纯化后的肌原纤维悬浮于Tris -EDTA (10mmo l /L Tris ,5mm ol /L EDTA pH 8.0)缓冲液然后加入同体积的变性处理液(125m mol /L Tris,4%SDS,20%g lycerol),在50℃水锅中加热20min 后,离心(16000×g )30min ,用BCA 试剂盒测定蛋白浓度后用含10%巯基乙醇和0.01%的溴芬兰的变性处理液将蛋白浓度稀释到3.5mg /m L 。

样品再经50℃水浴锅中加热20min 后放于-80℃超低温冰箱备用。

1.2.3　变性聚丙酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE )
Titin 和nebulin 大分子蛋白电泳参考Huff-Lo ner-ga n 的方法[6]
,为胶浓度5%的连续变性电泳,丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺为100∶1;tro po nin -T 的分离采用Laemmli 电泳系统,为变性不连续电泳,分离胶浓度12.5%,浓缩胶浓度4%,丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺为37.5∶1。

电泳后的胶用考马斯亮兰染色1h ,在脱色液中脱色过夜。

Desmin 的电泳如tro po nin -T ,但分离胶浓度为10%。

1.2.4　蛋白质印迹(w estern -blotting )
将电泳后的凝胶置于转移缓冲液(20m ol /L Tris,192mmo l /L 甘氨酸,15%甲醇)泡20min 后,采用湿法
将电泳凝胶中的desmin 转印到硝酸纤维膜上。

转印电流200m A ,1.5h 。

转印后的硝酸纤维膜用含5%脱脂奶粉的T TBS 溶液(30m mol /L Tris-HCl,500mmo l /L NaCl,0.05%Tw een 20,pH 7.5)封阻过夜,然后分别用1∶1000稀释的抗desmin 抗体室温反应1h ,在TTBS 溶液中浸洗3次,每次5min,加入1∶10000稀释的过氧化物标记羊抗兔免疫球蛋白抗体溶液中摇动1h ,经TTBS 浸洗后在暗室中采用化学发光(ECL )试剂检测蛋白信号强度,胶片曝光时间为1min ,曝光后的胶片分别经显影和定影处理。

2　结果与分析
2.1　不同处理对肌钙蛋白降解的影响
从不同处理样品分别培养1,3,7d 后,反映蛋白降解片段(30kDa )生成的SDS -PAGE 图(图1)可以看出,钙离子处理样品在1d 后便出现了30kDa 的降解片段(图1a );成熟3d 后对照组和EGTA 处理样品也出现了30kDa 的降解产物,但后者的条带较弱(图1b);在成熟7d 后,DEV D -C HO 处理样品才有少量肌钙蛋白T 的降解产物(图1c)。

而在其他处理组没能发现该蛋白片段的产生。

由于30kDa 的降解片段是肌原纤维蛋白重要组成蛋白肌钙蛋白T 的特征降解产物,且研究证实该产物的生成量和肉的嫩度有显著的相关性,所以很多学者将其作为反映肉成熟进程的内在指示因子。

注:2、3、4、5、6分别表示复合蛋白酶抑制剂、DEVD-CHO 、氯化钙和复合蛋白酶抑制剂、氯化钙、EGT A 处理的样品;
0和1分别代表0d 和对照样品,蛋白上样量为15μg
图1　不同处理对肌钙蛋白降解的影响
Fig .1
　Effects of diffe rent tr ea tments on deg ra da tion o f tro po nin -T 2.2　不同处理对伴肌球蛋白和伴肌动蛋白降解的影响
伴肌球蛋白(titin)是肌肉中最大的蛋白质,分子量约3000kDa ,从肌节的M 线延伸到Z 线,在A 带中和肌
球蛋白粗丝结合,在维持肌节的结构上发挥重要作用。

43
　第11期黄　明等:鸡肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制研究
从不同处理样品分别培养1,3,7d 后,反映蛋白降解片段生成的SDS-PAGE 图(图2)可以看出,0d 样品中伴肌球蛋白主要以T1型存在,另外还有少量的T2型,这和Huff -lonerg an 等[6]的结果一致。

在培养1d ,除复合酶抑制剂　DEV D -C HO 处理样品还能看到很少量的T 1型外,其他处理及培养3d 和7d 的所有样品已经检测不到T1型的伴肌球蛋白,此时该蛋白主要以T2型存在(图2)。

伴肌动蛋白分子量约600～900kDa ,在肌节中从
Z 线延伸到细丝的末端,和肌动蛋白细丝结合,同样也
起着维持肌节结构的作用。

复合酶抑制剂处理对伴肌动蛋白有明显的抑制作用,即使在成熟7d 后仍然有该蛋白的存在(图2c );DEV D -C HO 以及钙离子和复合酶抑制剂处理样品在培养3d 后仍有微弱的伴肌动蛋白条带出现(图2b),而其他处理样品在培养1d 后已经检测不到伴肌动蛋白的存在。

注:2、3、4、5、6分别表示复合蛋白酶抑制剂、DEVD-CHO 、氯化钙和复合蛋白酶抑制剂、氯化钙、EGT A 处理的样品;
0和1分别代表0d 和对照样品,蛋白上样量为80μg
图2　不同处理对伴肌球蛋白和伴肌动蛋白降解的影响
Fig .2　Effec ts o f different t reatments o n deg rada tio n o f titin and nebulin
2.3　不同处理对肌间线蛋白降解的影响
肌间线蛋白位于肌节的Z 线之间,和肌原纤维方向
垂直,有报道称该蛋白的降解和肉的嫩度和保水性相关[7]。

图3为不同处理样品分别培养1、3、7d 后,反映肌
间线蛋白降解的蛋白质印迹图谱,从图中可以看出,和肌钙蛋白T 的降解类似,和对照组相比,钙离子处理加
速了肌间线蛋白的降解,而其他处理则抑制了该蛋白的降解(图3)。

　注:2、3、4、5、6分别表示复合蛋白酶抑制剂、DEVD -CHO 、氯化钙和复合蛋白酶抑制剂、氯化钙、EGT A 处理的样品;
0和1分别代表0d 和对照样品,蛋白上样量为40μg
图3　不同处理对肌间线蛋白降解的影响
Fig .3
　Effects of differ ent trea tments o n deg radation of desmin 3　讨　论
多年的研究证实肉在成熟过程中嫩度的改善归因于肌肉结构蛋白质的有限降解,这些蛋白主要包括肌间
线蛋白(desmin)、肌原纤维内蛋白(titin,nebulin,
tropo nin-T)和肌膜连接蛋白(dystro phin,v inculin),在生理条件下,这些蛋白质起着维持肌细胞内肌原纤维的有序排列和肌原纤维在收缩和舒张中能量的缓冲和传递作用[6]。

在本试验中单独的钙离子处理显著加速了肌间线蛋白和肌原纤维内蛋白的降解,而在同样钙离子浓
44农业工程学报2007年　
度下添加复合酶抑制剂这些蛋白的降解受到抑制;另外在钙离子专一性螯合剂EGT A存在下,仍没能有效抑制蛋白的降解,这说明蛋白的降解并非完全钙离子的作用。

最近的研究发现μ-钙激活酶主要集中分布在肌节的N1和N2线区域并和伴肌球蛋白结合,只在骨骼肌表达的钙激活酶3(calpain3)也和伴肌球蛋白结合存在[8]。

而Takahashi等[1]的研究主要建立在在离体条件下通过初步纯化的肌原纤维和钙离子培养研究钙离子的作用,但忽略了钙激活酶和其它酶类可能仍结合在肌原纤维蛋白上,这些酶类可能仍然具有活性,所以Takahashi 等的结论还有待确认。

而本试验中不同处理样品伴肌球蛋白都发生了明显降解,很可能也与酶能和伴肌球蛋白结合有关。

在酶复合抑制剂处理的肉样中,蛋白的降解受到极大抑制,说明内源酶在这一过程中发挥主要作用。

本实验中所添加的复合酶抑制剂主要对丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶有抑制作用,钙激活酶和细胞凋亡酶都属于半胱氨酸蛋白酶。

而钙离子处理加速肌原纤维蛋白降解,这可能因为试验钙离子浓度可以充分激活钙激活酶,而在肉成熟过程中,通过肌浆网和线粒体释放到肌浆的钙离子浓度难以激活m-钙激活酶。

说明钙激活酶在这些蛋白的降解中的作用不容忽视。

我们以前的实验也证实了这一结论[9,10],但Koo hmaraie等认为对肉成熟的贡献主要归功于钙激活酶,而否定其它酶的作用,由于到目前钙激活酶在肌纤维中的分布、调控、激活失活机制并未阐明,另外肌纤维中还存在多种类型的钙激活酶内源抑制剂(calpastatins)所以钙激活酶在肉成熟中的作用仍须进一步研究[3]。

肉类动物屠宰放血后,由于氧供应的停止,肌细胞会很快进入死亡程序。

实验研究发现在缺氧条件下,细胞的死亡是有序过程,即凋亡(apoptosis)[11],所以肌细胞也很可能通过该途径死亡。

细胞凋亡是一个快速过程,并会通过级联反应(cascade effect)最终激活下游效应酶(caspase3,6,7)达到细胞死亡的目的[12]。

由于细胞凋亡效应酶3(caspa se3)在细胞凋亡过程中参与了大部分的主要细胞结构和骨架蛋白的降解,所以该酶在肉成熟中的作用更值得关注。

DE V D-CHO是胞凋亡效应酶3的专一抑制剂[13],经DEV D-C HO处理的肉样,肌肉蛋白的降解受到明显抑制,说明该酶很可能参与了肉的成熟。

所以肉的成熟应该是多种酶作用的结果。

4　结　论
肉的成熟主要是内源酶作用下的蛋白水解过程,除了钙激活酶外,细胞凋亡效应酶3也很可能参与了这一过程,而钙离子通过激活钙激活酶间接发挥作用。

所以肉成熟机理的研究应注重对内源酶的研究上,特别是肌细胞的死亡途径及其对肉成熟的影响还需深入研究。

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　第11期黄　明等:鸡肉在成熟过程中肌原纤维蛋白的降解机制研究
46农业工程学报2007年　
Mechanism of myofibrillar proteins degradation
during chicken postmortem aging
H uang Ming1,Zhao Lian1,Xu Xinglian1,Tang Xiaoyan2,Zhou Guanghong1※
(1.K ey Laboratory of Meat Processing and Quality Control,Ministry of Education,
N anjing Agricultural University,N anjing210095,China;
2.I nstitute of Quality Standard&Testing Technology for Agri-Products,C A AS100081China)
Abstract:In order to investiga te the m echanism underlying po stmo rtem proteolysis of m uscle pro teins during m ea t aging,fiv e broilers w ere slaug htered and treated indiv idually.After breast m uscles were removed,the samples a t death w ere obtained quickly.The other muscles w ere dissected into sm all blocks and divided into six g roups ra ndo mly.One g ro up ma rinated in solutio n co ntaining100mmo l/L Na Cl a nd2mm ol/L NaN3w as desig-nated as contro l,the others w ere soaked in solutions as co ntrols but containing30mmol/L EGTA,20mmo l/L Ca Cl2,pro tease inhibitor cocktail(10m L/tablet),100μmol/L caspase3selectiv e inhibito r(DEV D-C HO), 20m mol/L Ca Cl2plus protease inhibito r cocktail,respectiv ely in the ratio1∶1(W/V)(meat:solution),then stored at4℃fo r1,3,7d.At each co nditioning tim e point,mea t samples w ere obtained,a nd the chang es of m yofibril proteins(titin,nebulin,desmin,a nd troponin-T)w ere ex amined by SDS-PAGE a nd w ester n blo tting. Results rev eal that proteases inhibitor cocktail and DEV D-C HO inhibit myo fibril pro teins dig estion ma rkedly, w hereas calcium accelerated the process implying that the endog enous pro teases contribute to mea t pro tein deg ra-da tio n,calcium m ay play a role by activa ting calpains and that the apopto sis rela ted caspase-3is po ssibly ano ther new bio logical candidate invo lv ed in m ea t tenderizatio n.
Key words:chicken;myo fibrillar pro tein;deg radatio n mechanism;aging;caspase-3;calcium。