基于网络药理学探究白藜芦醇抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2020.06.006实验动物与中医药专题基于网络药理学探究白藜芦醇抗大鼠

心肌缺血再灌注损伤的分子机制

张晓节，蒋磊

(安徽省第二人民医院药学部，合肥230041)

［摘要］目的基于网络药理学信息筛选方法，探究白藜芦醇(resveratrol,RSV)抗大鼠心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion,MI/R)损伤的作用，以及其在大鼠体内的作用机制。方法利用TCMSP数据库筛选RSV作用基因靶点，并利用GeneCards数据库筛选MI/R损伤相关靶基因。运用R语言软件对RSV和MI/R相关靶基因取交集，筛选得到RSV治疗MI/R损伤可能的靶基因，并通过Cytoscape软件绘制基因网络，筛选出核心靶基因；最后运 用R语言软件对这些靶基因进行GO及KEGG通路分析。将30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血再灌注组(MI/R)和白藜芦醇给药组(RSV)。通过结扎左冠状动脉前降支诱导MI/R损伤大鼠模型，然后测定大鼠血浆中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTn I)含量以及心肌梗死面积。HE染色观察心肌结构，TUNEL染色检测心肌细胞凋亡，免疫组织化学和蛋白质印迹法检测心肌组织中凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)表达。结果网络药理学信息筛选发现RSV治疗MI/R损伤的核心靶基因有86个，主要涉及细胞因子受体、磷酸酶结合和死亡受体等生物学过程，以及参与调控糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路和细胞凋亡信号通路。大鼠体内实验结果显示，相比于Sham组，MI/R组心肌组织中TRAIL蛋白表达水平明显升高(P<0.01),血浆LDH、CK及cTn I含量明显增加(均卩<0.01),心肌梗死面积增大，同时心肌组织中肌纤维排列紊乱，细胞凋亡率和caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Bcl-2表达明显下调(P<0.05);而RSV组心肌纤维排列相对规则，LDH、CK、cTn I含量及TRAIL 蛋白表达量减少，心肌梗死面积减少，细胞凋亡率降低(均P<0.05)。结论RSV可能通过调节TRAIL蛋白表达抑制细胞凋亡，从而逆转MI/R损伤.

［关键词］网络药理学；白藜芦醇；心肌缺血再灌注损伤；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；

细胞凋亡；大鼠

［中图分类号］Q95-33［文献标志码］A［文章编号］1674-5817(2020)06-0496-10

急性心肌梗死是冠状动脉急性或持续性缺血缺氧导致心肌组织坏死。心肌细胞大量死亡,严

［收稿日期］2020-04-30

［作者简介］张晓节(1992—),女，硕士，药师，研究方向：药理学。E-mail:*******************

［通信作者］蒋磊(1982—),男，硕丄；副主任药师，研究方向：药理学。E-mail:********************重影响患者的预后。心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion MI/R)损伤是扌旨心肌短时间内供血不足或停止，之后又恢复供血，进而造成心肌组织损伤的过程⑴。研究表明，导致MI/R 损伤的机制包括细胞坏死、细胞凋亡、钙超载，以及过量氧自由基的产生等［2-4］。目前，治疗MI/R 损伤的有效药物尚不完全明确。

白藜芦醇（resveratrol,RSV）是存在于桑树、花生或朝鲜槐等多种植物中的一种非黄酮类多酚化合物。既往研究证实，RSV能够通过减少MI/R损伤、舒缓血管或者抗动脉粥样硬化等途径发挥保护心血管系统的作用［5-6］。然而，有关RSV治疗MI/R损伤的具体分子机制尚不清楚。网络药理学是基于整体构想，通过构建多层次的复杂网络，发现关键节点即关键靶基因，然后以此对疾病的发病机制和药物干预作用机制进行有效预测。

本研究采用网络药理学信息筛选方法，从RSV治疗MI/R损伤的整体分子作用角度出发，探寻RSV治疗的有效靶基因，然后通过动物体内实验验证RSV治疗MI/R损伤的分了机制，为RSV 应用于临床治疗提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠30几体质量为（200土20）g,6〜8周龄，由安徽医科大学实验动物中心提供［SCXK（皖）2017-001］。所有大鼠在25°C左右、相对湿度为40%〜70%的环境［SYXK （皖）2017-004］中适应性饲养7d,然后进行动物实验。本实验方案通过安徽医科大学动物伦理委员会审核批准（IACUC：20170625006）

1.2药物与试剂

RSV粉末（纯度高于99%）和戊巴比妥钠（批号：57-33-0）均购自美国Sigma公司；蛋白质印迹法检测用兔抗caspase-3单克隆抗体（#9662）和小鼠抗Bcl-2单克隆抗体（#3498）均购自美国Cell Signaling Technology公司，小鼠抗肿瘤坏死因了相关凋亡诱导配体（tumor necro­sis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）单克隆抗体（15497-1-AP）购自中国武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗GAPDH单克隆抗体（AF5009）、一抗稀释液、二抗稀释液、HE 染色试剂盒和TUNEL染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购自武汉博士徳生物工程有限公司；小鼠抗TRAIL一抗免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。大鼠血浆中乳 酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）和心肌肌钙蛋白I （cardiac troponin I,cTn I）含量测定用试剂盒购自碧玄天生物技术研究所。

1.3RSV与MI/R损伤靶基因筛选及调控网络图构建

通过中药系统药理学数据库（https://lsp. /tcmsp.php）筛选得到RSV有效作用靶基因，然后采用GeneCards数据库（https:// /）筛选得到MI/R损伤相关靶基因。最后运用R语言软件包中的VennDiagram 程序包，对RSV作用与MI/R损伤相关的靶基因取交集，再利用Cytoscape软件（https:// /）,导入这些交集基因，构建基因调控网络。

1.4GO功能富集分析和KEGG通路分析

运用R语言软件包中的String和Colorspace稈序包，对基因调控网络进行GO功能富集分析，并画出关键基因的富集分析柱状图及气泡图。使用模糊聚类算法，以注释共同度为基础，对基因进行聚类计算，得出聚类分值，该分值代表该基因在基因调控网络中的重要性。然后根据GO富集分析结果，运用R语言软件包中的Bioconductor程序包，进彳亍KEGG通路分析，得到RSV治疗MI/R损伤涉及的主要信号通路。采用超几何分布设计法进行KEGG富集分析，富集分析的显著性按照Benjamini-Hochberg校正法进行计算。

1.5动物建模与分组

实验大鼠随机分为3组，即假于术组（Sham 组）、心肌缺血再灌注组（MI/R组）及药物治疗组（RS V组），每组各10只。采用戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位固定，大鼠四肢通过肢体导联针与呼吸机连接，记录II导联心电图，分肉;左侧冠状动脉。Sham 组只穿线不结扎左冠状动脉前降支；MI/R组和RSV组结扎左冠状动脉前降支约40min,然后松开结扎线再灌注2ho在整个过程中，以缺血时心肌组织变白且心电图ST段抬高，再灌注时心肌变红且ST段下降，视为造模成功。RSV组大鼠于舌下静脉滴注用生理盐水（即0.9%氯化钠