红曲霉培养培养条件的研究

红曲霉培养培养条件的研究
开题报告
红曲霉培养培养条件的研究
1背景及其研究意义
红曲霉以其产生红曲色素而得名。

红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，红曲色素具有稳定性很好，蛋白着色力强，色调柔和，酸碱稳定等优点。

随着人们对合成色素具有诱发癌症等毒副作用的认识，天然食用色素日益受到重视。

红曲色素是由红曲霉丝状真菌经发酵而合成的天然色素，由黄色及红色等6种色素组成。

红曲霉属真菌门，子囊菌纲，真子囊菌亚纲，曲霉科，菌丝体呈紫红色，菌丝体生长过程中会产生大量胞外色素和胞内色素。

可用传统的固体发酵法生产，也可用液体发酵的现代技术生产红曲霉素红曲霉主要用于食品添加剂而具有安全保健的功能。

目前，红曲霉的生产工艺已由传统的固体发酵转向液体深层通气发酵，大大提高了色素的产量和纯度。

本课题采取液体深层发酵的方式生产红曲霉素，并研究红曲色素的提取及在食品中的应用：同传统工艺相比，具有更适应大规模，自动化生产的特点。

本课题主要开展液体深层发酵条件的研究，找出红曲霉培养的最佳环境条件，包括温度、酸度、装量纱布层数、转速、发酵时间等。

2实验方法
2.1菌种选择
选取易于培养、产色能力强的红曲霉。

2.2培养基
一级培养基：饴糖5%蛋白胨1.5%琼脂3%PH自然
121℃高压灭菌30分钟
二级培养基：麦芽糖5%豆饼粉2%K2HPO4.3H2O0.5%MgSO4.7H2O
0.25%H2O1000ml PH自然121℃灭菌30分钟
2.3工艺流程
菌种→斜面培养→摇瓶培养→发酵罐培养→测量色价
2.4具体方案
选择出最佳培养条件，设计正交实验进行实验
因素温度(℃)发酵时间(h)转速（r/min）酸度纱布层数(层)装量（ml）12048100 5.5230 22360120 6.0440 ******** 6.6650 427841607.0860 530961807.51070
采用上述培养基配方，根据表格设计安排实验。

2.5测定色价
取发酵液离心后，分别对上清液和沉淀进行了处理，测定胞内色素和胞外色素的OD值，然后把OD值转换为色价，则总色价=胞外因素色价+胞内因素色价。

3预期达到的目标
通过实验，比较总色价，找出最价的正交组合，得出红曲霉的适应培养条件。

红曲霉培养条件的研究
万方早
指导老师石鹤
（湖北师范学院生物系湖北黄石435002）
【摘要】本文采用正交实验，通过液体深层发酵的方法，研究了红曲霉产红色素的各种培养的条件，实验结果表明最佳培养条件为：温度28℃，PH：6.0，纱布层数为8层，转速180r/min,装量50ml/250ml,发酵时间为96h.在次培养条件下，发酵液的总色价可达43.6u/ml.
【关键词】红曲霉液体发酵培养条件研究
【中图分类号】TQ925+
红曲霉以其能生产大量红曲色素而得名。

自古以来在我国一直用于食品着色，特别是肉类的着色。

然而我国传统的固态发酵法存在很多缺点，不适宜大规模生产。

红曲色素作为天然色素，消费量逐年增加，进行红曲色素的液体发酵生产已经成为发展趋势。

本文通过对红曲霉产色的最佳培养条件的研究，以提高产色率，为工业化大生产提
供参数。

1材料和方法
1.1材料
菌种：红曲霉AS3.782
斜面培养基：饴糖5%蛋白胨1.5%琼脂3%PH自然
121℃高压灭菌30分钟
种子培养基：玉米粉5%豆饼粉2%MgSO4.7H2O1.5%
K2HPO4.3H2O0.1%PH自然120℃高压灭菌30分钟
发酵培养基：葡萄糖4%豆饼粉2%K2HPO4.3H2O0.5%
MgSO4.7H2O0.25%PH自然
1.2色价的测定方法
1.2.1酒精法
吸取100目-120目尼龙布过滤后的发酵液2ml，加95%的乙醇5ml摇匀，静置10-15分钟，加蒸馏水3ml,摇匀，过滤（定性滤纸过滤）。

以50%的乙醇做对照，在722分光光度计上，用510nm，d=1cm厚的比色皿比色，测定光度OD值，再乘以稀释倍数（N）。

即为发酵液的色素量。

1.2.2抽滤法
胞外色素：发酵液→砂芯漏斗→滤液直接稀释比色→测出胞外色素含量胞内色素：发酵液→砂芯漏斗→滤纸上的滤渣→用755乙醇浸提→抽滤得色素再比色→测出胞内色素含量
发酵液总色素量=（胞外色素含量+胞内色素含量）×稀释倍数
1.3实验仪器
无菌操作台722型分光光度计电子天平干燥器恒温培养箱高压灭菌锅摇床电热器自控发酵罐（10L）
1.4工艺流程
1.4.1
菌种→斜面培养（30℃，培养7天）→摇瓶培养→测定色价
1.4.2
菌种→斜面培养（30℃，培养7天）→药瓶种子培养（28℃，
48h）→发酵罐培养（28℃，72h）→测定色价
1.5摇瓶培养条件实验
利用摇瓶培养红曲霉时，除最佳培养基外，还必须对温度、酸度、通气量加以研究。

培养条件对发酵液的总色价有较大影响，按表1设计实验。

表1最佳培养条件选择实验的因素水平
因素温度（℃）酸度纱布层数(层)转速(r/min)装量(ml)发酵时间（h）122 5.041202560
225 5.561404072
328 6.081805084
430 6.5102006096
5327.01222075108
根据表1安排实验，接入培养7天的红曲霉孢子悬液5ml,按实验要求培养相应时间。

测定每毫升发酵液的总色价。

1.6发酵罐实验
在摇床实验的基础上，按表2的设计进行发酵罐培养实验。

表2发酵罐实验方案
培养基罐压（Mpa）PH搅拌速度（r/min）通风量（L/min）温度（℃）玉米粉4%0.05 6.0220128
豆饼粉2%0.05 6.0220128
葡萄糖4%1 6.0250128
豆饼粉2%1 6.0250128根据表2利用0L的发酵罐幢L培养液进行实验，接入培养48h的红曲霉液体种子700ml，培养60h，测定每毫升发酵液的总色价。

2实验结果分析
2.1不同温度对产色素的影响
温度能影响微生物中酶的活性、细胞质膜的流动性及物质的溶解度，根据表1的安排，测得实验结果如表3：
表3温度对色价的影响
温度（℃）2225283032
色价（u/ml）20.429.735.430.227.1
实验结果表明：红曲霉的适宜生长温度为25-30℃。

次温度范围有利与红曲霉中细胞物质的合成、营养物质的吸收与次级代谢产物的积累。

此时，菌丝体能分泌较多的红曲色素，而当温度过高或过低时，红曲霉中细胞质膜的流动性减小，酶的活性降低，使菌丝体分泌色素减少。

2.2溶解氧对发酵产色的影响
在摇瓶液体培养过程中，影响摇瓶中溶解氧的因素很多，为了了解红曲霉的生长和产色对溶解氧的需求状况，根据实验条件对溶解氧分3个(因素纱布盖口层数，250ml锥型瓶装量，摇床转速)进行研究。

实验结果见表4：
表4溶解氧对发酵产色的影响
瓶号纱布层数（层）转速（r/min）装量（ml）色价（u/ml）
181802510.2
281804025.6
381805038.5
481806021.7
581807512.1
661805016.4
7101805018.5
812180508.2
981405026.8
10815050染菌
11820050染菌
12822050染菌
实验结果表明：纱布层数、转速、装量均会影响红曲霉产色的结果。

当纱布层数为8层、转速为180r/min,装量为50ml/250ml是产色效果最好。

说明红曲霉为好氧菌，且需氧量较大。

因此在发酵罐中应控制好通风量和搅拌速度，满足菌体生长和产色的需要。

2.3培养基酸度对产色的影响
培养基PH值影响微生物的细胞膜的透性，膜结构的稳定性，，物质的溶解性及营养物质的吸收，从而影响红曲霉的生长和新陈代谢，最终影响产色。

完成表1设计的不同酸度实验，测得实验结果如表5：表5培养基PH对产色的影响
配制时（PH） 5.5 6.0 6.57.0
色价（u/ml）24.931.825.517.4实验结果表明：最适PH值为6，同时还发现偏酸时对产色的影响较小，而偏碱时对产色的影响较大。

因此在实际生产中应对酸碱度加以严格控制。

2.4培养时间对产色的影响
培养时间的长短对代谢产物的积累有较大的影响，根据真菌生长和次级代谢产物积累的一般规律，按表1设计的培养时间进行实验，其结果如表6：
表6不同培养时间对产色的影响
培养时间（h）60728496108
色价（u/ml）8.219.529.732.815.3实验结果表明：最适培养时间为84-96h,此时菌丝体物量处为最大值。

分泌红曲色素较多：当培养时间低于60h时。

菌丝细长，分生孢子尚未形成，产色素量少：当培养时间超过108h时，分生刨子散落，子囊果开始形成，此时营养底物含量很低。

色素被作为营养物消耗，因此，在实际操作中需要注意把握。

2.5验证实验
对以上结果进行分析，可知温度为28℃，PH为6.0，纱布盖口层数为8层，转速为180r/min,装量为50ml/250ml,发酵时间为96h时，红曲霉产色效果最好。

为确证该组合为最佳培养条件，安排一次论证实验，共做10瓶，其结果如表7：
表7验证实验结果
实验号12345678910色价
（u/ml）
31.337.436.643.626.834.728.830.240.925.4
由实验结果可知：当红曲霉处于最佳培养条件时。

红曲霉总色价可达
43.6u/ml,且此时红曲霉菌丝体相互紧密缠绕，呈颗粒状，悬浮在发酵液
中，产色稳定，色价高。

此艺参数可作为工业生产的参考依据。

2.6发酵罐实验
按表2的设计进行实验，结果如表8：
表8上罐发酵实验
罐号罐压（Mpa）PH 搅拌速度
（r/min）
通风量
（L/min）
温度（℃）
色价
（u/min）
10.05 6.0220128+/-114.3
21 6.0250128+/-118.1
从第一罐和第二罐的比较可以看出，增加罐压，搅拌速度及通风量可以增加氧气与红曲霉的接触。

有利于红曲霉的生长和色素的积累。

3结论
3.1和验证实验均表明当温度为28℃，PH=6.0，纱布层数为8层，转树为18.r/min,装量为50ml/250ml,发酵时间为96h时，红曲霉能较好的积累红曲色素。

3.2培养条件下。

菌株产色稳定。

色价可达43.6u/ml.
3.3上罐实验，初步确定了培养红曲霉的PH，温度及通气量。

搅拌速度、罐压等工艺参数，对红曲霉色素的工业化生产有一定的价值。

3.4通过摇瓶、上罐实验发现菌种有些退化，对产色有一定影响。

参考文献：
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红曲霉液体发酵和红色素提取的研究。

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RESERCH ABOUT THE CULTURE CONDITIAN OF MONASCUS 【Abstract】The paper uses the orthogonal test,researches the monascus producing monascus pigmeng by deep liqid state fermentation.The reaults show that the optimal culture condition are these of28℃,ph=6.0,96h,50ml,180r/min and8F.the total pigment value reaches to43.6u/ml under these culture condition.
【Key words】Monascus Liquid state fermentation Reasearch of condition。