【NatNeurosci】一条有故事的X染色体

【NatNeurosci】⼀条有故事的X染⾊体

脆性X染⾊体综合征(Fragile X syndrome, FXS)，是导致智⼒障碍最常见的遗传性因素，也是⾃闭症的最⾼单基因致病因素，发病率仅次于21-三体综合征。致病原因是X染⾊体上Fmr1基因发⽣突变，导致维持脑部正常神经传导的脆性X智⼒低下蛋⽩（FMRP）制造量减少或缺乏。临床表现为智⼒低下、语⾔障碍、⾏为异常、发育迟缓、⾯容特殊等，并伴有孤独症、⾃闭症、癫痫等症状。⼀旦发病，⽆有效治疗⼿段，给家庭带来沉重的⼼理和经济负担。

图⽚来源：CDC

2019年2⽉11⽇，《Nature Neuroscience》刊登了威斯康星⼤学麦迪逊分校Zhao Xinyu团队的最新研究⼯作[1]，他们发现了线粒体融合可以改善FMRP缺失导致的神经元发育受损，Htt可以介导FMRP调控线粒体融合和树突成熟，提⽰了FMRP和HTT在FXS发病机制中的相互作⽤，提⾼了⼈们对该领域的认知。

Zhao Xinyu 图⽚来源：

University of Wisconsin-Madison

结果

1、FMRP对神经细胞的成熟过程⾄关重要

⾸先，作者通过DCX-CreERT2⿏（DCX启动⼦诱导表达Cre酶）、TdT reporter⿏（Cre依赖表达tdTomato红⾊荧光蛋⽩的report⿏）以及Fmr1loxp/+⿏杂交获得cKO⿏（tamoxifen诱导条件性敲除FMRP⿏，图1a）。他们对6周龄的cKO⿏和对照⿏注射tamoxifen（TAM），并取注射后3d、7d、14d、28d、56d（对应于新⽣神经元发育的关键阶段）的组织进⾏分析[2]（图

1b），发现TAM诱导Cre重组酶在DCX+细胞中表达，导致FMRP在DCX+细胞中的选择性缺失（图1d-e）。

随后，他们对海马齿状回颗粒下层（SGZ）的tdT+细胞数进⾏量化（图1c），结果发

现，FMRP的选择性缺失，使未成熟神经元数量在最初阶段有⼀个短暂的增加，⽽在发育成熟的最后阶段则显著性减少，最终导致新成熟神经元数量减少（图1f-m）。

图1 FMRP选择性缺失影响神经元的发育过程

接下来，作者在FMRP-cKO⿏（Fmr1loxp/y）和FMRP-cON⿏（Fmr1loxp-Neo/y）[3]的DG区注射retro-pDcx-Cre和retro-flip-GFP混合病毒（图2a-c），结果发现，与WT⿏相⽐，注射后28天，cKO⿏的DCX+新⽣神经元树突复杂性、总长度、分⽀点及端点的数量显著降低；⽽在cON ⿏中，由于FMRP恢复，改善了cON⿏的DCX+神经元树突形态的缺陷（图2d-h）。这提⽰了在DCX+新⽣神经元中FMRP的表达对树突成熟的重要性。

进⼀步，为了评估未成熟神经元中FMRP缺失对新⽣神经元突触传递的功能影响，他们在cKO⿏的DG区注射retro-hSyn-Cre-GFP病毒，4-5周后，记录GFP+神经元的诱发动作电位（AP）和微⼩⾃发性兴奋性突触后电流（mEPSCs），结果表明，未成熟神经元中FMRP的缺失会影响其接受兴奋性传递的能⼒（图2i-n）。这些结果提⽰了，FMRP在神经细胞成熟过程中的重要作⽤。

图2 未成熟神经元中FMRP缺失导致神经元发育受损

2、FMRP缺失影响代谢过程

为了研究FMRP调控新⽣神经元发育成熟的分⼦机制，作者将Fmr1-KO⼩⿏和Dcx-DsRed转基因⿏进⾏杂交[4]。⽤荧光激活细胞分选技术（FACS）分离⼩⿏DG区中的DsRed+细胞后（图3a,b）。转录组学分析出了与代谢相关的差异基因（图3c,d）。神经代谢⾼度依赖线粒体功能[5]，作者的研究发现，从Fmr1-KO⿏分离的海马神经元中，参与线粒体功能的⼏个差异基因的表达⽔平发⽣了变化，为证明这种变化与FMRP缺失有关，他们检测了硝基酪氨酸⽔平发现，与

对照组相⽐，cKO⼩⿏的tdT+神经元的硝基酪氨酸⽔平升⾼（图3e,f）。

随后，作者在Fmr1-KO⿏和WT⿏的DG区注射Retro-pCAG-mitoDsRed病毒来观察新⽣神经元中线粒体形态（图3g），结果发现，FMRP缺失的未成熟神经元中线粒体碎⽚较多（图3h,i）。这些结果提⽰了，未成熟神经元中FMRP表达缺失会显著影响代谢过程，这可能是由线粒体功能障碍引起的。

图3 FMRP缺失影响代谢过程

3、线粒体融合改善FMRP缺失神经元的成熟过程

接下来，科研⼈员⽤mitoDsRed和GFP转染从Fmr1-KO⿏分离出的神经元，结果发现，与WT相⽐，Fmr1-KO⿏神经元中线粒体的纵横⽐、膜电位均显著降低（图4a-d），这提⽰了FMRP缺失会损害⼩⿏神经元线粒体功能。

线粒体可以通过分裂或融合发⽣频繁的形态学变化[6]，因此他们假设FMRP缺失的神经元线粒体纵横⽐降低可能是由于裂变增加或融合减少导致的，随后作者⽤光电开关实验验证这⼀假设，即Fmr1-KO⿏神经元中线粒体融合减少（图4e-h）。

图4 FMRP缺失的未成熟神经元中线粒体融合受损

进⼀步，他们⽤M1（可促进线粒体融合，恢复线粒体管状⽹络结构）处理Fmr1-KO和WT⿏神经元，结果发现，线粒体融合的恢复显著改善了FMRP缺乏导致的树突成熟度受损现象（图5）。

图5 增强线粒体融合可改善FMRP缺陷的未成熟神经元

4、HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损

接下来，作者研究了FMRP调控线粒体融合的机制。他们从BioGRID数据库中找出最可能参与未成熟神经元线粒体FMRP调控的靶点基因-Htt，随后，评估了未成熟神经元中HTT蛋⽩表达、Htt mRNA表达⽔平，结果发现，与对照组相⽐，cKO⿏DG区中tdT+神经元的HTT免疫染⾊强度明显降低（图6a,b），此外，Fmr1-KO⿏DG区和原代海马神经元的Htt mRNA⽔平均显著性降低（图6c,d）。

进⼀步，作者⽤慢病毒介导的shRNA感染海马神经元，⼲扰Htt，发现病毒感染神经元HTT的mRNA⽔平和蛋⽩⽔平以及MFN2（线粒体融合蛋⽩2，介导线粒体外膜融合）和OPA1（视神经萎缩1，介导线粒体内膜融合）的mRNA⽔平和蛋⽩⽔平均显著降低（图6e-l），此外，HTT 敲低的海马神经元的树突状复杂性、长度以及节点数量也显著降低（图6m-p）。这些数据提⽰了，未成熟神经元中HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损，这与FMRP缺失导致的发育神经元发育受损表型⼀致。

图6 HTT缺失导致线粒体融合基因表达减少以及树突成熟度受损

5、HTT表达增强可改善FMRP缺失神经元的线粒体融合

为了检验Htt降低是否与FMRP缺失神经元中线粒体缺陷有关，作者利⽤CRISPR/dCas9技术进⾏内源基因转录激活[7]。他们将设计的⼗条sgRNA靶序列转染Neuro2A细胞，筛选出能使内源性Htt mRNA⽔平和HTT蛋⽩⽔平表达显著性增强的sgRNA（图7a,b）。随后科研⼈员⽤筛选出来的sgRNA和dCas9-V164感染Fmr1-KO和WT⿏原代海马神经，结果发现，KO和WT⿏神经元中HTT蛋⽩表达⽔平就显著升⾼，更重要的是，KO⼩⿏神经元中HTT⽔平恢复到WT的⽔平（图7d）。此外，内源性Htt基因的激活提⾼了Fmr1-KO⿏神经元中线粒体的纵横⽐、降低了硝基酪氨酸⽔平（图7d,f），并改善了神经元的树突复杂度（图8a-c）。提⽰了，HTT是FMRP调控线粒体功能和神经元成熟的核⼼。

图7 HTT表达增强可改善FMRP缺失神经元的线粒体融合