RNA的提取学习课件

RNA的检测： 将样品稀释液于三处波长处读取OD值。 记录OD值，通过计算确定RNA浓度或纯度。 公式如下 对于ssDNA：[ssDNA]＝33×(OD260一OD310) ×稀释倍数
对于dsDNA：[dsDNA]＝50×(OD260—OD 310) ×稀释倍数 对于ssRNA：[ssRNA]＝40×(OD260一OD310)×稀释倍数 以上浓度单位为ug／mL.
谢谢！
小结： 半定量时必需设计内参照。 内参的长度与目的片段相差100bp以上，否则电泳时不能很好分开 内参的退火温度应与目的片段相当，最好控制在1-2 ℃左右，且退火温度不要太高。 有时内参与目的基因引物之间可以形成二聚体，导致条带暗，可以分开PCR, 然后加在一起电泳。
进行基因克隆时应在引物上加酶切位点，尽量选用常用酶，如BamH I，EcoR I, Hind III 等便于连接到表达载体上。 产量低时可通过增加模版量，增加循环数量来解决。
0.5至 l ug RNA 。 1．25mmol／L dNTPs(dATP，dTTP, dCTP, dGTP). 1.6 ug的随机六聚物（pd[N] 6)。
2uL 10xRT buffer 200 u 逆转录酶 加DEPC处理过的双蒸水至总体积为20ul， 于37℃反应lh．然后于94度加热5min以终止反应。
3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理：每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液，放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时。然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活。
4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶。 5)分离RNA以前，将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 ℃ 烘烤4h以灭活核酶。如有可能，将其他设备也灭菌处理。
逆转录聚合酶链式反应 (RT—PCR)
RT—PCR间接用来扩增从RNA分子今得到的一段特异序列。RNA首先被逆转录为cDNA。用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以cDNA为摸板的PCR产物成为一个标准的PCR反应。得到阳性产物说明存在着特异的RNA序列。
对于—个成功的PCR反应来说，寡聚核苷酸引物是最重要的组分。引物的长度范围通常在18至25个核苷酸之间。用常规条件扩增的PCR产物的长度范围为100一1000bp。为了扩增从mRNA逆转录得到的cDNA，引物中应含有一段目的基因的内含子区，以便从带有基因组DNA的PCR产物中区分出cDNA的PCR产物。
应用 从组织或细胞中分离细胞的总RNA 从液体样品中分离RNA
TRI REAGENT (Tripure) 是一种用于RNA 分离的商品溶液。该法源于chomc- zynski 的RNA分离一步法。它更便于使用并且结果更加可靠。对于来源有限的样品，我们推荐使用这种试剂。这种试剂能从同一样品中同时分离RNA, DNA,蛋白质。
一步法RT—PCR
优点：一步法RT-PCR排除了在将cDNA转至PCR反应混合体系过程中可能出现的污染和吸量的变化。避免了在逆转录反应结束阶段的变性过程中可能发生的cDNA蒸发。 缺点：对于新手来说，一次不成功须从第一步重新开始。
方案 0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP(每种) 2 umol／L随机六聚物pd(N) 200 U AMV逆转录酶 1×Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmol／L MgCI2 1 mmo1／L DTT 1.5U Taq聚台酶 0.5umol／L的引物(每种) 终体积为50ul。
应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，因此，RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步，也是关键的一步。
提取RNA 过程中防止wenku.baidu.comNA酶的污染所采取的步骤
RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA)，也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA)。在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用，它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量，或用于RNA的生化研究，
处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用途和来源。由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。
方案： 工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好，特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作。通常认为这些区域富含RNA酶。 如有可能，使用标有“无RNA酶”的商品试管、吸头、溶液和水。通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶，
4 ℃下12000g离心15min。 将水相(上部)转至一个新EP管。每1mL Tripure加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。将样品置于室温下5—10min。
4 ℃，12000g离心10min。凝胶样沉淀物为RNA。 吸出上清并用1mL 75％乙醇在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次， 4 ℃, 7500g 离心5min. 晾干RNA沉淀．然后用无RNA酶的水，甲酰胺或0.5X 的 SDS溶液溶解沉淀。
许多计算机程序，诸如Primer Primer5.0，使得最适引物的选择十分便利。评判标准包括GC含量，解链温度，引物—引物二聚体和特异性。
应用 1. 利用有限的总RNA量测定一段持异的RNA信息； 2. 进行PCR克隆。
逆转录 1) 用分光光度计测定A260以确定RNA浓度。 2)RT反应混合物包括以下组分(20ul)：
RNA的提取
RNA和无RNA酶的环境
原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA， 信使RNA(mRNA)、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA(tRNA)。而真核生物则能产生四种，还有一种为真核生物所持有的小RNA。mRNA是由基因转录而来的，它运送编码蛋白所需的信息。 由于mRNA代表了基因表达的水平，因此mRNA的分离、定量和检测极为重要。
方案 ． 用l mL Tripure／50－100mg (组织)匀浆组织样品。对于细胞、每10cm2面积(贴壁的单层细胞)或每106个细胞(细胞沉淀)使用1mL。将样品转至1.5mLEP管中。(-70 ℃可保存1月) 室温下放置样品5min。每1mL Tripure中加入0.2mL氯仿并摇动15s，置于室温下 2—15min。
一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶。细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶。因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施。
分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整。rRNA(18s和28s) 条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。
一步法分离RNA
从组织中提取RNA则要注意： 动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿 组织器官的冲洗液
人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换。 记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾，它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸。这些可能造成RNA酶的污染
PCR扩增 将以下组分混合(50ul)以进行PCR扩增： a．从上面反应中逆转录得到的10ul cDNA。 b．1U的Taq聚合酶。
c． 引物(0.2umol/L)。 d．5ul 10×PCR缓冲液(o．5mmol／L MgCl2, 50mmol/L KCl, 10mmol／L Tris·HCl，0.001％明胶) e．加双蒸水使总体积为50ul。 f. 编程，开始PCR
注意事项 1)OD310值是背景，若盐浓度较高，OD310”值也高。 2)OD260／OD280 对DNA而言其值大约为1.8，高于1.8有RNA污染．低于1.8则有蛋白质污染。 3)OD260／OD280。对RNA而言其值大约为2.0。
小结 所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理。 操作过程中应带口罩，手套。 DEPC有致癌之可能，尽量避免接触皮肤 提取的RNA应尽早逆转录成 cDNA.