彗星试验步骤

彗星试验步骤

1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。

1.5.4.1 制片

将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。

1.5.4.2 铺胶

取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。

1.5.4.3 裂解

轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。

1.5.4.4 解旋

从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。

1.5.4.5 电泳

电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。

1.5.4.6 漂洗及染色

电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。

以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。

1.5.4.7 结果观察

荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全

长－头长，计算各剂量组的平均尾长。

表1.1 MMS、MMC和NaN3的WTK1细胞彗星试验结果Table 1.1 Comet assay of MMS, MMC and NaN3 with WTK1 cell line

Chemical

Conc.

(μg/ml)

0h 20h

RG a (%)

Comet

cell (%)

TL

(x±s, μm)

RG a

(%)

Comet

cell (%)

TL

(x±s, μm)

MMS 0 100.0 6.0 3.50±1.69 100.0 3.0 3.67±3.13

0.625 97.2 10.0 10.38±2.92** 98.8 8.0 6.50±3.05**

1.25 100.4 18.0* 24.25±4.88** 97.7 11.0 8.90±3.52**

2.5 96.4 3

3.0** 32.08±7.40** 88.3 15.0** 18.62±

4.04**

5 94.8 60.0** 52.33±5.68** 86.8 44.0** 46.00±5.36** K2Cr2O7147 92.4 100.0** 78.70±4.39** －－－MMC 0 100.0 6.0 2.57±1.7

6 100.0 5.0 1.75±1.76

0.0625 100.4 6.0 3.70±1.86 96.2 9.0 3.62±1.92

0.125 108.1 10.0 4.04±1.52 54.6 19.0** 5.50±1.81**

0.25 104.5 11.0 3.92±1.42 52.7 50.0** 22.87±3.95**

0.5 87.8 17.0* 4.93±3.63 48.8 64.0** 50.17±5.80** K2Cr2O7147 105.4 100.0** 68.19±5.15** －－－NaN30 100.0 8.0 3.12±1.69 100.0 9.0 2.15±1.67 250 90.0 7.0 3.03±1.48 99.0 6.0 2.85±1.58

500 102.5 8.0 3.35±1.16 97.7 9.0 3.10±1.83

1000 89.4 14.0 4.09±1.57 88.3 11.0 3.16±1.29

2000 92.2 56.0** 14.93±4.54** 86.8 52.0** 11.25±1.38** K2Cr2O7147 92.5 100.0** 72.33±6.12** －－－

a Relative growth compared with corresponding solvent control

*P<0.05 **P<0.01, compared with corresponding solvent control