生物样品验证指标和分析方法学考核

第四节生物样品测定方法的验证指标和分析方法的考核
任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。

一般而言，常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性范围、重现性、耐用性等。

生物样品中药物分析方法评价的标准与上述评价指标之间，既有共同点也有其独特之处，测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度，也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。

与其他分析方法相比，体内药物分析方法的可行性和可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。

在实际工作中评价一个体内药物分析方法的优劣，一般常用精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性及可测浓度范围等指标进行考察。

一、生物样品测定方法的验证指标
(一)准确度准确度(accuracy)是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性，是考察和评价分析方法的最基本要点之一。

由于不可能绝对地确知样品的“真值”，因而常用回收率数值反映测定的准确程度。

也可通过与其他已建立的分析方法进行比较等手段来反映准确度。

回收率是指将已知量的药物纯品加到空白生物基质(如空白血浆、血清)中，经过一系列的前处理、测定，计算所测得的药物量与加入量的比值，以百分率表示。

一般回收率数值越接近100％，准确程度越好。

生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P(present)的真实样品(如人血浆样品
等)，再加入药物标准晶已知量A．(added)，将该混合物作为测定液，其测定值为M(measured)。

测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3-5次，求出每种浓度的平均测定值M，且RSD应符合要求。

由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3-5次，求其平均值P，且RSD也应符合要求。

按上式计算出的回收率，其结果越接近100％表明分析方法准确度越高。

生物样品分析时，一般应将回收率范围控制在85％-115％(样品药浓≥2m心L)及80％-120％(样品药浓<200t~,／L)o但因生物样品组分复杂，药物含量低，前处理步骤多很难达到较高的回收率。

对一种分析方法来说，更重要的是每次测得的回收率要保持恒定，虽然有时回收率较低，但只要重现性好，通过校正后仍可采用。

回收率根据测定方法不同，又可分为绝对回收率和方法回收率。

1．绝对回收率。

绝对回收率又称为萃取回收率或提取回收率，它反映了一种方法的萃取效率，与生物样品检测灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要指标之一。

现以色谱为例说明绝对回收率的求算过程。

分别取一定量被测药物标准品两份，其中一份加到空白样品中，按设定方法处理、进样测定，测得色谱峰面积为A测；另一份用纯品溶剂溶解并稀释使其浓度与第一份处理后浓度一致，进样测得色谱峰面积为A真，其回收率为：回收率(％)=A测／A真×100％。

绝对回收率应考察高、中、低三个浓度，高浓度在标准曲线的上限附近，低浓度选择在定量限附近，中间选一个浓度。

对于回收率的大小与变异不宜苛求，一般
添加量在10—6—10-9g，绝对回收率若能达到50％—80％，应该是令人满意的。

色谱分析中采用内标法测定含量，分别取相同量的药物标准品和内标物质两份。

其中一份加到空白样品中，按设定方法处理，测得药物和内标峰面积，求出它们的比值=A药／A内。

另一份用纯溶剂溶液进样，测得药物和内标峰面积，计算其比值。

然后根据下式求出回收率：回收率(％)=R测／R真×100％在内标法中，要求药物与内标物各自用外标法测得的绝对回收率应相近，相差小于10％，否则回收率偏离100％太远。

2．方法回收率
取一系列浓度的药物标准品加到空白体液中，按设定的分析方法测定，根据标准品浓度及相应的测定信号值绘制标准曲线，进行回归并求出回归方程，然后取高、中、低浓度的药物标准品加到空白体液中，按标准曲线制备方法同法测定，每个浓度至少平行测定5份，测得信号值代人回归方程，求得相应的测定值。

测得量与加入量比较，即得方法回收率，除定量限外，各浓度点测得的平均值偏离实际加入量应少于15％，定量限这一点应小于20％。

回收率测定时，不管采用哪种方法，要求添加的药物量必须与实际测量相近，必须与实际存在的状态相似，必须同时做空白试验，否则测得结果不可靠。

因此报道一个方法的回收率时，必须说明添加量。

(二)精密度(precision)是指同一均质样品的测定结果与平均值的偏离程度，或者说多次测定结果彼此符合的程度，它表示分析方法的可重复性。

它有多种表示方法，在体内药物分析中常用以下方法表示。

1．标准差(standarddeviation，SD或S)的计算公式为：
SD=
2．相对标准差相对标准差(Relative8tandaddeviation，RSD)，也称变异系数(CV)的计算公式为RSD=CV/SD×100％。

精密度测定通常采用高、中、低三种浓度进行测定，高浓度选择在标准曲线的上限附近，低浓度选择在定量限附近，中间选一个浓度。

测定时每种浓度的样品应重复测定3-5次，按上式计算测定结果的标准差和相对标准差。

在定量限外各浓度点RSD不应大于15％，最低定量限这一点不应大于20％。

生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可分为日内(或批内)精密度和日间(或批间)精密度。

日内(或批内)精密度(within—runprecision)考察分析方法在短期内测定结果的变异情况。

凡是在同一天内将样品多次测定所计算出的精密度称为日间精密度；凡在同一批内样品多次测定所计算出的精密度称为批内精密度。

所谓“批内”是指测定时使用同批试剂、同一条标准曲线等主要条件相同情况下完成的分析测定。

所得RSD应争取达到5％以内，最差不能超过10％。

日间(或批间)精密度(between—nmprecision)考察分析方法在不同时间测定结果的变异情况。

由于体内药物分析面临样品数量多，测定持续时间长，往往在同一天或同一批内不能完成，样品测定时使用的仪器性能、试剂、标准曲线及环境条件等都可能发生微小的变化，从
而导致分析结果的变异增大。

因此，考察分析方法的精密度时，还应考察日间或批间精密度。

通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7—10份，置冰箱冷冻。

白配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。

所得RSD应控制在15％以内。

(三)灵敏度灵敏度是指一种分析方法可检出有关化合物的最小量，常用以下三种表示方法：
1．检测限，检测限(LOD)是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时所需样品中药物的最低浓度。

通常以被测信号和背景噪音比(简称信噪比)S／N为2-3倍时的被测物的绝对量来表示，LOD=3N／S(N=噪音，S=被测物信号／单位质量)。

也可通过多次空白试验，求得背景响应的标准差，再乘以2或3作为LOD的估计值。

2．定量限定量限(LOQ)是指在保证具有一定可靠性的前提下，分析方法能定量测定出样品中药物的最低量。

它与检测限的不同在于定量限规定的最低测得量应该符合一定的精密度和准确度的要求。

在体内药物分析中，通常以标准曲线的最低浓度点作为定量限。

也可以S／N为10或空白背景响应值的标准差乘以10作为估计值，再通过试验确定。

在体内药物分析中，进行药物制剂人体生物利用度和生物等效性测定时，对LOQ的要求至少能满足测定3-5个半衰期时的样品中药物浓度，或C max的1／10～1/120时的药物浓度。

3．最低检测浓度·最低检测浓度多指可进行定量测定的某一药物的最低浓度。

它与样品体积大小有关，可由以下公式求得：
最低检测浓度=LOQ／进样体积
上述表示灵敏度的方法均指仪器的灵敏度，即进人仪器的最低绝对量或最低浓度。

如果仪器的灵敏度相同，而生物样品预处理方法不同，就有可能影响。

因此，要提高检测方法的灵敏度，除了选择高灵敏度的仪器外，还可采取提高进样量、降低仪器噪音；提高样品的浓缩程度或降低样品稀释度；消除干扰、降低空白值等措施。

(四)分析方法的专属性
分析方法的专属性(specificity)又称选择性(selectivity)，通常是指样品中含有其他共存物质时，分析方法能够准确、专一地测定出药物的能力。

即测得的响应值应该是属于被测物所特有的，否则就易受干扰。

在生物药物分析时，考察一个方法的专属性或选择性应着重考虑：(1)内源性物质的干扰：可取空白样品(如空白血浆)试验。

色谱分析时，要求药物和内标峰附近无干扰峰；光谱分析时，要求药物的测定波长处应无杂质吸收或荧光。

(2)代谢产物是否会干扰原药的测定响应值，可用给药数次后病人的尿液(含代谢物)来进行试验。

若药物在体内代谢情况为已知，且可获得代谢物标准品，则可将其加入空白样品以及加人实际样品中，验证是否有干扰。

(3)在临床药物监测时要考虑同时服用药物的干扰。

·专属性的测定以色谱法为例，通常取空白样品，采用拟定的方法进行测定，所得结果与接近于定量限的被测物浓度的纯溶剂溶液所得结果进行比较。

在药物、代谢物、内标物的保留时间处不应有大的干扰，任何有大的干扰的空白应舍去，需重新改变拟订的方法，以消除干扰。

在报告专属性时，至少要提供空白生物样品色谱图，空白生物样品加标准品或内标物色谱图及服药后生物样品的色谱图。

色谱分析除可用色谱图表明同时服用药物不干扰外，还可以分别列出这些药物的保留时间，显示有无干扰。

(五)线性范围线性范围(1inearityandrange)是指一种分析方法的精密度、准确度都符合要求的试验结果成线性时供试物浓度的变化范围。

在体内药物分析中，通常是将药物标准品加入空白体液中，制备标准系列，按拟定分析方法处理、测定，然后绘制标准曲线，或计算回归方程，求出相关系数和线性范围。

标准曲线的制备以色谱法为例，一般由一个空白，一个空白样品加内标和5-8个浓度的标准系列组成，要求覆盖实际的样品浓度范围，包括LOQ。

空白和空白加内标不用于标准曲线的绘制，仅作为对于扰的考察。

标准曲线的线性程度目前仍广泛采用相关系数(r)表示，一般，不应低于0.99，同时必须符合一定的精密度和准确度。

标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定，一般要求浓度上限为样品最高浓度的120％，下限为样品最低浓度的80％，但应高于LOQ。

(六)稳定性
稳定性(stability)是指药物的稳定性，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数。

在实际工作中，首先要考察药物标准溶液的稳定性，其次考察药物在生物样品中的稳定性。

药物
在生物样品中的稳定性包括：在室温条件下的稳定性要超过在冷冻条件下的稳定性；反复冷冻一解冻条件下的稳定性考察。

1．短期室温条件下稳定性考察
通常取高、低浓度各3份于室温下放置4-24小时测定，测得结果均与0小时的进行比较。

2．长期低温条件下稳定性考察
长期贮存时间应超过收集第一个样品至最后一个样品分析所需要的时间周期。

储存温度—-般为0~20C，如果需要也可在0~70C贮存。

要求高、低浓度至少分别测定3次，测得结果分别与第一天测得的相应浓度的结果进行比较。

3．冷冻一解冻稳定性考察
取高、低浓度样品至少各3份，于20℃左右贮存24小时，取出置室温放置使自然解冻，当融解完全后，取样进行分析测定，然后再把样品放回冷冻状态保持12—24小时，如此解冻一冷冻重复循环两次以上，分别比较各次分析测定的结果。

另外，药物与内标的贮存溶液的稳定性的考察，一般应在室温条件下进行6小时内的稳定性考察。

然后将其冷藏或冷冻7-14天或恰当时期后进行测定，将测得结果与新鲜配制溶液的测得结果进行比较。

(七)与参比方法测得结果的相关程度的比较
由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。

因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。

比较试验时，取若
干份实际样品(如病人服药后采取的血样)，用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药物浓度为横坐标(X)，以新建立方法测得的药物浓度为纵坐标(Y)做成散布图(scatterdiagram)，并求出直线回归方程(y=a+bx)及相关系数(r)。

r最大值为1，表示两法完全相关(结果完全吻合)；r=0时，表示两法完全不相关。

一般要求两法的相关系数r≥0．95，而相关直线的斜率(b)应接近于1。

以HPLC法测定血清中链霉素浓度为例：此新方法测定血清中链霉素，原理是在链霉素碱性条件下过茚三酮柱后衍生产生荧光，用离子对—HPLC法、荧光检测器检测；并用荧光偏振免疫测定法(fluorescence polarization inllllunoa-say，FPIA)作为参比方法同时进行测定对照，比较相关的程度，结果表明两法相关性良好。