微生物大小的测定及显微镜直接计数法

微生物大小的测定及显微镜直接计数法微生物的大小测定与显微计数
生32 程雨婧 2013012406
一、实验目的
1. 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。

2. 了解血细胞计数板的构造及计数原理。

3. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理
1. 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。

镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。

用于校正目镜测微尺的长度.目镜测微尺的中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度(见图1),再以后作为测量微生物细胞的长度。

2. 球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示(μm)
图一:测微尺的校正
3. 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种:一种是计数区(大方格)分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

计数区由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面
2积为lmm，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体3积为0.1mm。

使用血球计数板计数时，通常测定四或五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。

设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则: A441mL菌液中的总菌数= ×25×10×B=5×10×A?B (25个中格) 5
图二:血细胞计数室构造
三、实验器材
1. 菌种:啤酒酵母
2. 器材:普通光学显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水、血细胞计数板、计数器、吸管、生理盐水、移液器。

四、操作步骤
1. 酵母菌大小测定。

(1) 校正目镜测微尺
进行目镜测微尺的校正。

将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。

先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺
所占的格数(图一)。

用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。

由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的实际长度。

两重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每格长度(μm)= 两重合线间目镜测微尺格数
(2) 菌体大小的测定
将稀释到适宜浓度的少量酵母菌培养液涂在载玻片上，盖上盖玻片，放在载物台上先用低倍镜找到目的物，再用高倍镜观察，往盖玻片上滴加半滴镜油，再换油镜观察，观察时可转动目镜，使目镜测微尺位于酵母细胞的长轴或短轴上，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格。

测出的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。

一般测量菌体的大小要在同一个标本拍片测定20个菌体，算出平均值，才能代表该菌的大小，要按顺序随机选取各种大小菌体进行测量，不能只挑大的细胞测量。

(3) 测定完毕
取出目镜测微尺镜头，换上原目镜，再将目镜测微尺和物镜测微尺擦干净包好归还。

2. 显微镜计数。

(1) 镜检计数室:加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污染物需要清洗，干燥后使用
(2) 菌悬液的制备:用生理盐水将菌液稀释，以每中格10-20个酵母菌为宜。

(3) 加样品:血细胞计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用移液器吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，让菌液靠毛细渗透作用自动进入计数室。

(4) 显微镜计数:将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，静置1min 后，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

(5) 清洗血细胞计数板:使用完毕后，将血细胞计数板进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。

切勿用硬物刷。

(6) 计数方法: 25×16规格的计数板，需选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。

若有菌体位于格线上，则计右边界和上边界。

如遇酵母出芽，芽体未脱落的大小达到母体一半以上的要记，已脱落的不管大小都要记。

每个样品重复上样并计数10次，取平均值。

五、注意事项
1. 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜或油镜校正时，务必小心，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。

2. 细菌的个体微小，在进行细胞大小测定时一般应选用油镜，以减小误差。

3. 换不同物镜或目镜要重新标定目镜测微尺和目镜测微尺。

4. 将稀释到适宜浓度的少量酵母菌液涂在载玻片而不是镜台测微尺上。

5. 酵母菌计数加样品前，一定将菌液摇匀。

加样时计数室不可有气泡。

6. 进行显微镜计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。

用40×高倍镜计数。

7. 注意调节显微镜光线的强弱，用低倍镜找计数室时，光线要暗一些。

六、实验结果
1. 目镜测微尺校正结果 (准确到整小格)
表1 目镜测微尺标定结果
物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格长度(μm) 目镜(10×) (小格) (小格)
100× 50 5 1
2. 酵母菌大小测定结果
表2 酵母菌大小测定结果
菌号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目镜测微尺格数(长轴) 6.5 7.3 6.9 6.1 6.8 5.5 7.1 8.0 6.5 8.9 目镜测微尺格数(短轴) 5.0 6.6 5.2 4.2 5.5 4.0 6.0 6.5 5.1 7.0
菌号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 目镜测微尺格数(长轴) 6.8 6.5 8.1 6.0 6.9 7.2 7.0 6.0 6.6 7.3 目镜测微尺格数(短轴) 6.1 5.2 6.7 5.5 5.3 6.0 5.1 5.8 5.7 6.8
酵母长轴平均值(μm) = 6.90?0.79 (保留小数点后两位)
酵母短轴平均值(μm) = 5.66?0.82 (保留小数点后两位)
3. 酵母菌显微计数结果
表3 酵母菌显微计数结果
实验各中格中菌数总菌数稀释平均值菌数个/ml 次数倍数左上左下
右上右下中
1 13 10 11 19 20 73
2 10 18 24 12 6 70
3 31 16 19 27 13 106
4 23 13 12 11 12 71 720 83.7 8.37×10
5 17 24 19 10 14 84
6 1
7 14 12 17 19 79
7 14 19 23 12 16 84
8 17 21 22 19 24 103
9 15 21 20 21 12 89
10 9 18 18 17 16 78
图三:一个中格中的酵母菌
思考题和小结七、
1. 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正,
答:因为在不同放大倍数的目镜或物镜下，目镜测微尺每格代表的长度会发生变化。

2. 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同,为什么,显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗?
答:相同。

因为用不同的物镜时都重新校正目镜测微尺，目镜测微尺每格代表的长度可按照重新校正的数据计算。

显微测微尺上的刻度大小和放大倍数不会影响到测量结果
3. 哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何减少误差力求准确, 答:器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差;由于仪器(计数板、盖片、吸管等)不够准确与精密带来的误差;由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。

前两者可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正;细胞分布误差可通过多次计数取平均值来减小。

4. 假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量。

V=4πabc/3(a=b
为半短轴，c为半长轴) 酵母-6-6-6-16 3答:V=4π×5.66×10×5.66×10
×6.90×10/3=9.25×10m 酵母-16 37酵母菌的体积含量
=9.25×10m×8.37×10/ml=0.077ml/ml
小结
本次实验中，我们学习了如何使用血细胞平板计数法测量微生物的数量和使用显微测微尺测量细胞大小，基本上掌握了其原理与操作，对微生物大小的测定有了一定的了解和掌握，对微生物的大小尺度有了一定的认识，感觉收获较大。

在进行微生物形态和数量的测量时要看清实验要求和具体情况，使用正确的方法和选择。

比如，酵母菌大小测量时菌体的选取以及计数时中格的选取。