单分子电泳纳米孔道电化学的新认识

２０２０年９月Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０２０
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
９９３ ９９８
毛细管电泳专辑（上）㊃研究快报
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０２０．０５００１
收稿日期：２０２０⁃０５⁃０１
∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０２５）８９６８０３４９，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｉｔａｏｌｏｎｇ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．基金项目：国家自然科学基金（２１８３４００１）．
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．２１８３４００１）．
单分子电泳：纳米孔道电化学的新认识
张伟为１，㊀应佚伦２，㊀龙亿涛１，２∗
（１．华东理工大学化学与分子工程学院，上海２００２３７；
２．南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏南京２１００２３）
摘要：该文旨在从电泳分离技术的角度认识纳米孔道电化学单分子分析技术，这种技术可以作为 单分子电泳 来理解和研究㊂纳米孔道电化学单分子分析技术与电泳的本质都是采用外加电场使待测分子产生电迁移㊂待测分子性质不同，且与介质材料孔道外露基团相互作用不同，使得分子移动速度具有差异，据此实现分离识别㊂气单胞菌溶素（Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）纳米孔道，由于其孔径与待测分子尺寸相匹配，其孔道内壁可以看作是由氨基酸组成的具有调控单个分子电迁移能力的特异性孔道界面㊂每一个氨基酸残基都相当于一个探测单元，在电场力的作用下，待测分子逐一进入孔道时与每一个探测单元相互作用方式㊁程度与时长不同，从而形成了单个待测分子特征的迁移速度和迁移运动轨迹㊂在纳米孔道实验中，每秒可以有上千个待测分子穿过孔道，产生特征阻断电流信号㊂通过对这些信号的阻断电流㊁阻断时间㊁阻断频率㊁信号特征等进行统计分析，可以从 单分子电泳 水平对单个待测物实现高通量的分辨和识别㊂该文以Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道分辨仅有一个核苷酸差异的寡聚核苷酸（５ᶄ⁃ＣＡＡ⁃３ᶄ㊁５ᶄ⁃ＣＡＡＡ⁃３ᶄ㊁５ᶄ⁃ＣＡＡＡＡ⁃３ᶄ）为例，详细阐述了纳米孔道 单分子电泳 的单核苷酸分辨能力，展现了电化学限域空间在
电泳单分子水平分离技术上的应用㊂关键词：单分子电泳；纳米孔道；电化学
中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０２０）０９⁃０９９３⁃０６
Ｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｎｅｗｅｄｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ
ｏｆｎａｎｏｐｏｒｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ＺＨＡＮＧＷｅｉ⁃Ｗｅｉ１，ＹＩＮＧＹｉ⁃Ｌｕｎ２，ＬＯＮＧＹｉ⁃Ｔａｏ１，２∗
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｉｍｓｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｒｏｍｔｈｅｓｔａｎｄｐｏｉｎｔｏｆｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｃｏｕｌｄｂｅｒｅｇａｒｄｅｄａｓ ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ．Ｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｃａｓｅｏｆｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｔｈｅｓｉｎｇｌｅｔａｒｇｅｔｍｏｌｅｃｕｌｅｓｍｉｇｒａｔｅｉｎｓｉｄｅａｎａｎｏｐｏｒｅｕｎｄｅｒａｎｅｘｔｅｒｎａｌｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄ．Ｔｈｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｂｉｌ⁃ｉｔｙｏｆｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｍａｉｎｌｙｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｃｈａｒｇｅ，ｓｈａｐｅ，ａｎｄｓｉｚｅｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｍｏｌｅｃｕｌｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｒｃｅ．ＴｈｅｃｏｎｆｉｎｅｄｓｐａｃｅｏｆａｎＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｍａｔｃｈｅｓｔｈｅｓｉｚｅｏｆｓｉｎｇｌｅｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓａｌｏｎｇｔｈｅｉｎｎｅｒｗａｌｌｏｆｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅｅｌｅｃ⁃ｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｓｉｄｅｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅａｐｐｌｉｅｄｖｏｌｔａｇｅ，ｅａｃｈｍｏｌｅｃｕｌｅｅｎｔｅｒｓｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅ，ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｍｉｇｒａｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙａｎｄｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔａｍｐｌｉｔｕｄｅ，ｄｕｒａｔｉｏｎ，ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ａｎｄｓｈａｐｅｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｉｇ⁃
ｎａｌｓｗｏｕｌｄｈｅｌｐｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙａｓｉｎｇｌｅａｎａｌｙｔｅｆｒｏｍｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅ．Ｈｅｒｅｉｎ，ｗｅｕｓｅｄａｎＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｏｆ５ᶄ⁃ＣＡＡ⁃３ᶄ（ＣＡ２），５ᶄ⁃ＣＡＡＡ⁃３ᶄ
（ＣＡ３），ａｎｄ５ᶄ⁃ＣＡＡＡＡ⁃３ᶄ（ＣＡ４），ｗｈｉｃｈｄｉｆｆｅｒｉｎｌｅｎｇｔｈｏｎｌｙｂｙｏｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｓｔｈｅｍｏｄｅｌ
色谱第３８卷ｓｙｓｔｅｍｔｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＴｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｔｈｅＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｉｓａｒｏｕｎｄ１ｎｍ，ａｎｄｔｈｅｐｏｒｅｌｅｎｇｔｈｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１０ｎｍ．Ｕｎｄｅｒａｎａｐｐｌｉｅｄｖｏｌｔａｇｅｏｆ８０ｍＶ，ｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓａｈｉｇｈｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄｓｔｒｅｎｇｔｈｏｆａｂｏｕｔ８０ｋＶ／ｃｍ．Ｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｒｏｕｐｓｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｃａｒｒｙｎｅｇａｔｉｖｅｃｈａｒｇｅｓｉｎａｎｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ１ ０ｍｏｌ／ＬＫＣｌ，ａｔｐＨ８．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＣＡ２，ＣＡ３，ａｎｄＣＡ４ｃａｒｒｙ２，３，ａｎｄ４ｎｅｇａｔｉｖｅｃｈａｒｇｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｄｕｒｉｎｇｎａｎｏｐｏｒｅｓｅｎｓｉｎｇ，ＣＡ２，ＣＡ３，ａｎｄＣＡ４ａｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｆｏｒｃｅｓａｎｄｔｈｕｓｍｏｖｅｉｎｓｉｄｅｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅ．ＢｅｃａｕｓｅｔｈｅＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｉｓａｎｉｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｔｈｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｏｆｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｉｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅａｎｉｏｎｆｌｏｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｆｏｒｃｅａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃｆｌｏｗ，ＣＡ２，ＣＡ３，ＣＡ４ｗｉｌｌｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｉｇｒａｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ．Ｎｏｔｅｔｈａｔｔｈｅｏｌｉｇｏ⁃ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｈｏｗｓｓｔｒｏｎｇｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｔｗｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆＡｅｒｏｌｙｓｉｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｍｐｒｉｓｅｓｐｏｌａｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｒｏｕｎｄＲ２２０ａｎｄＫ２３８．ＴｈｅｓｔｒｏｎｇｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｇｉｏｎｏｆＡｅｒｏｌｙｓｉｎａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｔｅｗｏｕｌｄｆｕｒｔｈｅｒｍｏｄｕｌａｔｅｔｈｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｉｇｏ⁃ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｅａｃｈｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｆｏｌｌｏｗｓａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｒａｊｅｃｔｏｒｙａｓｉｔｉｎｄｉ⁃ｖｉｄｕａｌｌｙｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅ．Ｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｓｐｅｅｄａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｒａｊｅｃｔｏｒｙａｒｅｒｅ⁃ｃｏｒｄｅｄａｓｉｏｎｉｃｂｌｏｃｋａｇｅｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔｓｏｆｔｈｅｂｌｏｃｋａｇｅｃｕｒ⁃ｒｅｎｔａｎｄｂｌｏｃｋａｇｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｘｅｄｓａｍｐｌｅｏｆＣＡ２，ＣＡ３，ａｎｄＣＡ４ｓｈｏｗｔｈｒｅｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓａｓｓｉｇｎｅｄｔｏｅａｃｈｔｙｐｅｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｓｉｎｃｅｔｈｅｎｅｔｃｈａｒｇｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｗｉｔｈｉｎ⁃ｃｒｅａｓｉｎｇｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＣＡ３ａｎｄＣＡ４ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅａｓｔｒｏｎｇｅｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｆｏｒｃｅｔｈａｎｄｏｅｓＣＡ２ｉｎｓｉｄｅｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｈｉｇｈｅｒｍｉｇｒａｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｂｌｏｃｋ⁃ａｇｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆＣＡ３ａｎｄＣＡ４ｉｓ５ｔｉｍｅｓｌｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＣＡ２．
㊀ＢｙＧａｕｓｓｉａｎｆｉｔｔｉｎｇ，ｔｈｅｆｉｔｔｅｄｂｌｏｃｋａｇｅｃｕｒｒｅｎｔｓｏｆＣＡ２，ＣＡ３，ａｎｄＣＡ４ａｒｅ２０ ７，１５ ７，ａｎｄ１２ ７ｐＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｉｍｉｌａｒｔｏｏｕｒｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｈｅｂｌｏｃｋａｇｅｃｕｒｒｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｗｉｔｈｔｈｅｃｈａｉｎｌｅｎｇｔｈｗｈｅｎｔｈｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｃｏｍｐｒｉｓｅｎｏｔｍｏｒｅｔｈａｎ１４ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｎａｎｏｐｏｒｅ⁃ｂａｓｅｄｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｌｌｏｗｓｆｏｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＡ２，ＣＡ３，ａｎｄＣＡ４ｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｉｎａｌｅｎｇｔｈｂｙｏｎｌｙｏｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｎｃｅｐｔｗｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｃｏｎｆｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｉｎｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃ⁃ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈａｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍａｎｄａｎａｎｏｐｏｒｅａｒｒａｙｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏａｉｄｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｎａｎｏｐｏｒｅ；ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｃｏｎｆｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓ
㊀㊀电泳是指带电粒子在外加电场作用下以一定速度向电荷相反方向迁移运动的现象［１］㊂混合物中分析物的电荷量㊁分子大小㊁形状等不同，其在外加电场下的泳动速度也不同，从而实现混合物的分离［２－４］㊂以毛细管电泳为例，其以石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为主要推动力㊂毛细管的内径通常为２５ １００μｍ，长度一般为２０ １００ｃｍ，由于其比表面积大，易于散热，故可承受电场高达１０００Ｖ／ｃｍ㊂毛细管内壁界面的特殊结构产生双电层效应，使得待测物分子同时受到电渗流和电泳力的共同作用㊂待测分子在如此高的电场强度下，经过一个几十厘米长的毛细管道，分子之间运动的相对速度差异将更加明显，从而使毛细管电泳的分离效率㊁分离能力相比于传统电泳显著提高㊂
㊀㊀若将毛细管的长度缩短，同时内径也进一步缩小，达到纳米尺度，则其孔道内限域空间将与单个待测分子尺寸相匹配，在外加电场下，可达到极高的电场强度，有望实现单分子水平上的电泳分离㊂例如，将毛细管长度缩短为１０ｎｍ，孔径缩小为１ｎｍ，这种独特的限域空间，极大地增强了毛细管内电动力行为，仅需１００ｍＶ的施加电压，即可达到约１００ｋＶ／ｃｍ的超高电场强度㊂在这样的电化学限域空
㊃４９９㊃
㊀第９期张伟为，等：单分子电泳：纳米孔道电化学的新认识
间内，就可以实现单分子水平上的分离分析，如可以分析识别单个碱基长度［５，６］㊁单个氨基酸差异［７］，乃至单核苷酸甲基化［８］㊂为实现 单分子电泳 这一想法，亟须设计构建与单个分子尺寸匹配的分离测量界面㊂天然生物孔道蛋白，如Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ［９－１１］，α⁃Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ［１２－１４］等，其由一个蛋白质分子组成的限域孔道界面与单个生物分子如ＤＮＡ，多肽等尺寸类似，且其孔道内壁可以看作是由氨基酸组成的具有调控电迁移能力的特异性孔道界面㊂在电场力的作用下，单个待测分子逐一进入生物纳米孔道内部，孔道内的每一个氨基酸残基都相当于一个传感基元，待测物分子逐一穿过纳米孔道时会与内壁多个氨基酸残基发生时序性地相互作用㊂相互作用方式㊁程度与时长具有单分子特性，从而使得每一个待测分子在生物纳米孔道内的特征迁移速度和迁移运动轨迹不同，形成特征离子流阻断信号㊂每秒可以有上千个分子穿过孔道，通过对其进行统计分析，读取每一个离子流阻断信号的阻断电流㊁阻断时间㊁阻断频率以及信号特征，可以从单分子电泳水平对单个生物分子实现高通量的分辨与识别［１５］㊂
㊀㊀纳米孔道技术是基于８０年代人们受到的流式细胞仪的启发而提出的用单分子进行ＤＮＡ测序的思想而发展起来的一种单分子分析技术［１６］㊂在接下来的近１０年里，研究者一直在寻找合适的界面材料，即只能允许单链ＤＮＡ通过，而不能允许双链ＤＮＡ通过的界面材料，直到α⁃Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ的出现才正式让人看到这一设想可能变成现实的希望［１２，１７－２１］，由于分子穿过孔道的速度特别快，当时还难以准确捕获ＤＮＡ穿孔过程中的单个碱基序列信息㊂随着对孔道分辨能力的提高以及对仪器设备的不断更新，经过２０多年的科研投入，已研究出采用纳米孔道技术进行核酸测序的仪器并且实现商品化，进一步应用于新冠病毒核酸的检测，大幅提升了病毒阳性检出率［２２］㊂
㊀㊀本文基于Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ生物纳米孔道构建了 单分子电泳 分离体系，应用其实现了对仅有一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸差异的寡聚核苷酸分子５ᶄ⁃ＣＡＡ⁃３ᶄ（ＣＡ２）㊁５ᶄ⁃ＣＡＡＡ⁃３ᶄ（ＣＡ３）㊁５ᶄ⁃ＣＡＡＡＡ⁃３ᶄ（ＣＡ４）的分离识别，从电泳角度重新认识和理解了纳米孔道电化学单分子分析技术㊂
１㊀实验部分
１．１㊀仪器、试剂与材料㊀㊀纳米孔道检测池（ＷａｒｎｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ公司，美国）；ＣｈｅｍＣｌａｍｐ电流放大器（ＤａｇａｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ公司，美国）；Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａ数模转换器（ＡｘｏｎＩｎ⁃ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ公司，美国）；Ｃｌａｍｐｅｘ１０ ３数据记录软件（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ公司，美国）［５，２３，２４］㊂
㊀㊀实验所用溶液均采用超纯水（其电导率为１８ＭΩ／ｃｍ，２５ħ）进行配制㊂Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ蛋白通过大肠杆菌体系表达纯化所得；实验所用磷脂１，２⁃二植烷酰基磷脂（１，２⁃ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ⁃ｓｎ⁃ｇｌｙｃｅｒｏ⁃３⁃ｐｈｏｓ⁃ｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，２００ｍｇ）购自ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ公司（美国）；正癸烷购自Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ公司（美国）；乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ，ȡ９９ ９９５％）和三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，ȡ９９％）购自阿拉丁（中国）；氯化钾（ＫＣｌ，ȡ９９ ０％）购买Ｓｉｇｍａ⁃ａｌｄｒｉｃｈ公司（美国）；单链ＤＮＡ均购自生物工程有限公司（中国），本研究所涉及ＤＮＡ片段均在５ᶄ端不含磷酸基团［５，２３，２４］㊂实验所用直径为１ ０ｍｍ的银丝购自ＡｌｆａＡｅｓａｒ公司（英国），本实验采用电镀法进行Ａｇ／ＡｇＣｌ电极的制备㊂
１．２㊀纳米孔道检测体系的构建
㊀㊀如图１ａ所示，两个检测池紧紧地组装在一起，分别盛有１ ０ｍＬ的电解质溶液（１ ０ｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１ ０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ＝８ ０），其相连接处隔板中央有一个约５０μｍ的小孔可以将其连通，两检测池通过一对Ａｇ／ＡｇＣｌ电极施加电压构成电化学回路㊂通过笔刷蘸取一定浓度的磷脂正癸烷溶液，在连通两检测池的小孔处构建一层磷脂双分子层膜，此时两检测池被完全阻断，电流趋于０㊂在本研究中定义：接通电源负极的一端为ｃｉｓ端，正极的一端为ｔｒａｎｓ端，在ｃｉｓ端溶液中加入一定浓度的Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ蛋白，在施加电压（２００ ３５０ｍＶ）条件下，Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ蛋白单体在磷脂双分子层膜上自组装为单个孔径约为１ｎｍ，直径约为１０ｎｍ的七聚体生物纳米孔道，成为两检测池的唯一通道㊂如图１ｂ所示，此时连通两检测池的孔径由５０μｍ减小到１ｎｍ㊂当获得稳定的单个Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔通道时，在１００ｍＶ的施加电压下可产生约５０ｐＡ的开孔电流㊂
１．３㊀分析物检测
㊀㊀在获得稳定的Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道之后，在ｃｉｓ端溶液中加入待测物分子㊂在电泳力和电渗流的共同作用下，待测分子从ｃｉｓ端溶液穿过孔道到ｔｒａｎｓ端溶液中，穿孔过程中会因体积排阻效应排开孔道
㊃５９９㊃
色谱第３８
卷
图１㊀（ａ）纳米孔道电化学单分子分析技术原理图及（ｂ）Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ生物纳米孔道分离识别ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４Ｆｉｇ．１㊀Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆ（ａ）ｔｈｅｎａｎｏｐｏｒｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔａｎｄ（ｂ）ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ
ＣＡ２，ＣＡ３ａｎｄＣＡ４ｂｙａｎＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅ
ＣＡ２：５ᶄ⁃ＣＡＡ⁃３ᶄ；ＣＡ３：５ᶄ⁃ＣＡＡＡ⁃３ᶄ；ＣＡ４：５ᶄ⁃ＣＡＡＡＡ⁃３ᶄ；Ａ／Ｄｃｏｎｖｅｒｔｏｒ：ａｎａｌｏｇ⁃ｄｉｇｉｔａｌｃｏｎｖｅｒｔｏｒ．
内的部分电解质离子，从而使电流幅值下降，并且待测物分子穿孔过程中与孔道内壁的氨基酸残基产生相互作用，导致离子流呈现特征性变化㊂这些离子流信号由放大器放大，通过模数转化器转换成数字信号并记录㊂不同分子穿过纳米孔道时会引起不同阻断程度㊁阻断时间㊁阻断频率㊁阻断形状的离子流信号㊂通过对每一个阻断电流信号进行统计分析，可以获取单个待测物的成分㊁结构㊁尺寸㊁浓度㊁电性等信息㊂
㊀㊀本文的待测物是一组仅有一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸长度差异的寡聚核苷酸，分别为ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４㊂在ｃｉｓ端溶液中加入预混后的上述３种待测物分子，施加８０ｍＶ，实现实时监测３种不同的分子穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道的特征离子流信号㊂
２㊀结果与讨论
㊀㊀本实验中所采用的缓冲体系为ｐＨ＝８弱碱性环境，可使核苷酸的磷酸基团发生电离㊂因此，每个磷酸基团都将带有一个负电荷，ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４分别带有２㊁３㊁４个负电荷㊂由于Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道孔径仅为１ｎｍ，孔长仅为１０ｎｍ，故８０ｍＶ的施加电压即可造成约８０ｋＶ／ｃｍ的电场强度㊂带有不同电荷的ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４分子在孔道内将受到不同大小的电泳力，由ｃｉｓ端溶液迁移到ｔｒａｎｓ端溶液中㊂由于Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道对阴离子具有选择性，通过纳米孔道的电渗流方向与阴离子流动方向一致，故在Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道中电渗流的方向也是由ｃｉｓ端到ｔｒａｎｓ端［７］㊂所以，单个ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４分子在
电泳力和电渗流共同作用的驱动下穿过单个Ａｅｒｏｌ⁃ｙｓｉｎ纳米孔道㊂由于待测分子的带电荷量不同㊁分子尺寸不同，将会造成分子的迁移速度不同，导致分子的过孔持续时间不同，即电流阻断信号的阻断时间不同㊂此外，单个分子在纳米孔道限域空间内产生的离子流体积排阻大小不同，使得单个分子电流阻断信号具有特征阻断程度㊂更重要的是，Ａｅｒｏｌｙ⁃ｓｉｎ纳米孔道内壁界面含有两处含有极性氨基酸的灵敏区域［２５］（见图１ｂ），其与带负电荷的分子间具有强烈的静电相互作用，故而导致单个分子穿孔过程中迁移运动轨迹具有差异，即对电流阻断信号的阻断程度和阻断时间造成影响㊂
㊀㊀本实验结果表明，ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４分子在穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道时产生了３种阻断程度具有明显差别的电流阻断信号，其阻断电流值差别约为３
５ｐＡ（见图２ａ）㊂混合样品阻断电流和阻断时间散点图具有３个特征分布，分别可对应这３种相差一个核苷酸的ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４分子穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道时所引起的电流变化情况（见图２ｂ）㊂此外，散点图还显示出不同待测分子与孔道的作用时间也有较大差异，具体表现为ＣＡ３㊁ＣＡ４的阻断时间是ＣＡ２阻断时间的５倍，这表明ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４穿孔的迁移速度有较大差异，即待测分子带电荷量越高，所受电泳力将越强，故而在孔道内的迁移速度越高㊂㊀㊀本研究定义Ｉｒｅｓ为单个分子在Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道内时所造成的特征阻断电流值，对其进行高斯拟合，可以得到３种待测物分子穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道时对应的特征阻断电流值，拟合高斯峰电流分别为２０ ７㊁１５ ７㊁１２ ７ｐＡ（见图２ｃ）㊂本课题组之前的研究表明，位阻效应使得长度不超过１４个核苷酸的㊃
６９９㊃
㊀第９期
张伟为，等：单分子电泳：
纳米孔道电化学的新认识
图２㊀（ａ）３种分子穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道时产生的原始电流轨迹图㊁（ｂ）阻断时间和阻断电流的散点图和（ｃ）阻断电流直方图Ｆｉｇ．２㊀（ａ）ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓｒａｗｃｕｒｒｅｎｔｔｒａｃｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｔｈｅｔｈｒｅｅａｎａｌｙｔｅｓｔｒａｖｅｒｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈａｎＡｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅ，
（ｂ）ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔｓｏｆｔｈｅｄｕｒａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｉｄｕａｌｃｕｒｒｅｎｔ（Ｉｒｅｓ）ａｎｄ（ｃ）ｈｉｓｔｏｇｒａｍｏｆＩｒｅｓ
寡聚核苷酸穿过Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道时所造成的电
流阻断程度随链长的增加而增加［５，１１］，即Ｉｒｅｓ越小，分子的尺寸就越大，据此可以根据Ｉｒｅｓ依次分辨出ＣＡ２㊁ＣＡ３㊁ＣＡ４３种分子㊂
３㊀结论
㊀㊀本文从电泳技术的角度重新理解了纳米孔道电化学单分子分析技术，将其看作为纳米孔道单分子电泳技术㊂这种技术的特征在于孔道尺寸与分子尺寸相匹配，并且孔道内含有多个灵敏位点，分子在电泳力和电渗流的共同作用下逐一进入孔道，与孔道内多个灵敏位点发生有时序性的相互作用㊂由于分子运动速度㊁相互作用方式不同，从而产生不同阻断时长㊁阻断程度的特征性离子流信号，对其进行统计分析可以在单分子水平上实现仅有一个核苷酸差异的分辨㊂根据待测生物分子的电性和尺寸差异，Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ纳米孔道单分子电泳技术已应用于识别检
测仅相差一个净电荷的多肽序列［１５］㊁ＤＮＡ及多肽分子的多个磷酸化位点［２６，２７］，以及磷酸酶和激酶的催化活性［２６，２８］㊂进一步，通过调控电解质阳离子种类，
增强了单个待测分子进入孔道的能力，从而实现对小分子化合物（例如环二核苷酸）的超灵敏检测［２９］㊂㊀㊀生物纳米孔道可认为是一个由单个蛋白质分子组成的单分子界面，也是一个分离利用效率最高的界面㊂通过定点突变孔道内氨基酸技术可进一步调控孔道内壁电荷和与待测分子间相互作用［３０］，从而实现在混合样品中对带有同种电荷且电量相同的生物分子进行高灵敏性识别分析㊂更重要的是，待测分子与纳米孔道的相互作用具有时序性信息，结合微流控㊁阵列孔技术，未来有望从单分子水平上进行单个分子的分离识别㊂
致谢㊀特别感谢 毛细管电动分离分析前瞻研讨会 和中科院化学所陈义研究员在纳米孔道电泳理解方面对我们研究的指导和帮助㊂
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色谱第３８卷
参考文献：
［１］㊀ＣｈｅｎＹ．ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｃａ⁃ｔｉｏｎ．３ｒｄｅｄ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＰｒｅｓｓ，２０１９
陈义．毛细管电泳技术及应用．３版．北京：化学工业出版社，２０１９
［２］㊀ＬｉｕＭＸ，ＬｉＸＪ，ＢａｉＹ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａ⁃ｔｏｇｒａｐｈｙ，２０２０，３８（３）：３１７
刘明霞，李向军，白玉，等．色谱，２０２０，３８（３）：３１７［３］㊀ＰａｎＣＪ，ＷａｎｇＷＦ，ＣｈｅｎＸＧ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａ⁃ｔｏｇｒａｐｈｙ，２０１６，３４（１）：１６
潘聪洁，王伟峰，陈兴国．色谱，２０１６，３４（１）：１６［４］㊀ＷａｎｇＰＬ，ＬｉａｎｇＺ，ＺｈａｎｇＬＨ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０１１，２９（４）：３０３
王平利，梁振，张丽华，等．色谱，２０１１，２９（４）：３０３［５］㊀ＣａｏＣ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ＨｕＺＬ，ｅｔａｌ．ＮａｔＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，１１（８）：７１３
［６］㊀ＬｉＭＹ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ＬｏｎｇＹ⁃Ｔ．ＡｃｔａＣｈｉｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１９，７７（１０）：９８４
李孟寅，应佚伦，龙亿涛．化学学报，２０１９，７７（１０）：９８４［７］㊀ＹｕａｎＢ，ＬｉＳ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ，２０２０，１４５（４）：１１７９［８］㊀ＹｕＪ，ＣａｏＣ，ＬｏｎｇＹ⁃Ｔ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２０１７，８９（２１）：１１６８５［９］㊀ＰａｒｋｅｒＭＷ，ＢｕｃｋｌｅｙＪＴ，ＰｏｓｔｍａＪＰＭ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６７（６４６０）：２９２
［１０］㊀Ｐａｓｔｏｒｉｚａ⁃ＧａｌｌｅｇｏＭ，ＢｒｅｔｏｎＭＦ，ＤｉｓｃａｌａＦ，ｅｔａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１４，８（１１）：１１３５０
［１１］㊀ＣａｏＣ，ＬｉＭＹ，ＣｉｒａｕｑｕｉＮ，ｅｔａｌ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，２０１８，９（１）：１
［１２］㊀ＫａｓｉａｎｏｗｉｃｚＪＪ，ＢｒａｎｄｉｎＥ，ＢｒａｎｔｏｎＤ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９６，９３（２４）：１３７７０
［１３］㊀ＥｔｔｅｄｇｕｉＪ，ＫａｓｉａｎｏｗｉｃｚＪＪ，ＢａｌｉｊｅｐａｌｌｉＡ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２０１６，１３８（２３）：７２２８［１４］㊀ＡｙｕｂＭ，ＳｔｏｄｄａｒｔＤ，ＢａｙｌｅｙＨ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１５，９（８）：７８９５
［１５］㊀ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ＬｏｎｇＹ⁃Ｔ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２０１９，１４１（４０）：１５７２０
［１６］㊀ＤｅａｍｅｒＤ，ＡｋｅｓｏｎＭ，ＢｒａｎｔｏｎＤ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，３４（５）：５１８
［１７］㊀ＢａｙｌｅｙＨ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１０（１）：９４［１８］㊀ＢｒａｎｔｏｎＤ，ＤｅａｍｅｒＤＷ，ＭａｒｚｉａｌｉＡ，ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎ⁃ｏｌ，２００８，２６（１０）：１１４６
［１９］㊀ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＧＦ，ＤｅｋｋｅｒＣ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，３０（４）：３２６
［２０］㊀ＡｙｕｂＭ，ＢａｙｌｅｙＨ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１６，３４：１１７［２１］㊀ＨｏｗｏｒｋａＳ．ＮａｔＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７，１２（７）：６１９［２２］㊀ＷａｎｇＭ，ＦｕＡ，ＨｕＢ，ｅｔａｌ．ｍｅｄＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０ １１０１／２０２０ ０３ ０４ ２００２９５３８
［２３］㊀ＣａｏＣ，ＬｉａｏＤＦ，ＹｕＪ，ｅｔａｌ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，２０１７，１２（９）：１９０１
［２４］㊀ＣａｏＣ，ＬｉａｏＤＦ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ｅｔａｌ．ＡｃｔａＣｈｉｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１６，７４（９）：７３４
曹婵，廖冬芳，应佚伦，等．化学学报，２０１６，７４（９）：７３４［２５］㊀ＷａｎｇＹＱ，ＬｉＭＹ，ＱｉｕＨ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２０１８，９０（１３）：７７９０
［２６］㊀ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ＹａｎｇＪ，ＭｅｎｇＦＮ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１９，２０１９：１０５０７３５
［２７］㊀ＬｉＳ，ＷｕＸＹ，ＬｉＭＹ，ｅｔａｌ．ＳｍａｌｌＭｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０ １００２／ｓｍｔｄ．２０２００００１４
［２８］㊀ＭｅｎｇＦＮ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ＹａｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２０１９，９１（１５）：９９１０
［２９］㊀ＮｉｕＨＹ，ＨｕＺＬ，ＹｉｎｇＹ⁃Ｌ，ｅｔａｌ．ＡｃｔａＣｈｉｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１９，７７（１０）：９８９
牛红艳，胡正利，应佚伦，等．化学学报，２０１９，７７（１０）：９８９［３０］㊀ＷｕＸＹ，ＷａｎｇＭＢ，ＷａｎｇＹＱ，ｅｔａｌ．ＣＣＳＣｈｅｍ，２０１９，１（３）：３０４
㊃８９９㊃。