EMA与PCR结合检测大肠杆菌O157方法的研究

（EMA）与 PCR 结合，以 O157 特 有 的 抗 原 基 因 rfbE 为 靶 基 因 ，以 O157 的 纯 培 养 物 为 模 板 扩 增 ，进 行 灵 敏
度、特异性、曝光时间及最佳 EMA 浓度筛选实验。 结果显示：该检测方法的灵敏度为 1.2×102 CFU/mL，最佳
曝光时间为 1 min。 终浓度≥1 μg/mL 的 EMA，能有效抑制 O157 死菌的扩增，而当 EMA 终浓度≤16 μg/mL
分别用终浓度为 0、0.2、0.5、1、2、4、8 μg/mL 的 E-
M bp
2000
1000 750 500 250 100
12
34 5 6 78
M：DL 2 000 Marker；1：空 白 对 照 ；2～8：曝 光 时 间 分 别 为 0、1、2、4、6、8、10 min
图 1 最佳曝光交联时间的检测结果
≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤
理论基础并提供了试验依据，也为今后开展绵羊输卵 管组织或肌肉组织中 Ghrelin 基因表达变化情况的体 外试验提供了理论依据。
参考文献： ［1］ KOJIMA M，HOSODA H，DATE Y，et al. Ghrelin is a
［3］ 包图雅.17 β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞 β-防御素 基 因 表 达 的 影 响 及 可 能 的 信 号 通 路 ［D］.呼 和 浩 特 ：内 蒙 古 农 业 大 学 ，2010. （责任编辑：赵俊利）
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畜牧与饲料科学
第 35 卷
GAAGGTGGAATGGTTGT - 3 ′ ， 下 游 ： 5 ′ - CTCTT TCCTCTGCGGTCCTAGTTA -3′ ， 目 的 片 段 长 度 为 318 bp 。 引 物 由 大 连 宝 生 物 （TaKaRa ） 有 限 公 司 合 成。 1.2.2 EHEC O157 活菌和死菌的制备： 将 O157 标准 菌株在液体培养基中培养 18～24 h 后，取 1 mL 菌液于 EP 管中，12 000 g 离心 1 min，弃上清液，超纯水重悬， 用比浊仪将其调至 0.5 麦 氏 单 位 （MCF），作 为 活 菌 悬 液备用；另取一定体积的活菌悬液，于沸水中煮 10 min， 作为死菌悬液备用。 1.2.3 最佳曝光时间的确定：以终浓度为 1 μg/mL 的 EMA 处理 O157 死菌悬液，用 500 W 卤素灯分别照射 0、1、2、4、6、8、10 min，之后分别提取基因组 DNA 进行 rfbE 基因的 PCR 扩增， 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳 检测。 1.2.4 EMA 最佳处理浓度的筛选： 称取不 同 质 量 的 EMA 加入死 菌悬液中， 使其终浓度为分别为 0、0.2、 0.5、1、2、4、8 μg/mL， 活 菌 悬 液 中 也 加 入 不 同 质 量 的 EMA， 使 其 终 浓 度 为 分 别 为 0、0.2、0.5、1、2、4、8、16、 32、64 μg/mL。 将 2 种悬液充分震荡混匀后密封，在室 温条件下，置于黑暗处孵育 5 min，其间摇匀 2 次。 解 除 密 封 后 置 于 冰 浴 环 境 中 ， 用 500 W 卤 素 灯 照 射 1 min，悬液距灯 15 cm。 样品经 EMA 处理后，用于 DNA 模板的制备。 1.2.5 DNA 模板的制备： 采用煮沸法提取经 EMA 处 理样品的基因组 DNA。 1.2.6 PCR 方 法 的 建 立 ：PCR 反 应 采 用 50 μL 体 系 ， 组成如下：PCR Mix 25μL，ddH2O 18 μL，上下游引物各 1 μL，模板 DNA5 μL。 PCR 反应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变 性 30 s，60 ℃退 火 30 s，72℃延 伸 40 s， 35 个循环；72℃最后延伸 5 min；产物于 4 ℃保存。 1.2.7 引物特异性检测： 用液体培养基将 O157 标准 菌株及其他对照菌株复苏 1 代后， 以菌液为模板，用 上述引物进行 PCR 检测， 同时设空白对照， 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.8 PCR 灵敏性检测： 用灭菌棉签蘸取在 LB 琼脂 平板上生 长 了 24 h 的 O157 菌 落 ， 将 其 接 种 于 5 mL ddH2O 水中，调至 0.5 MCF，然后分别按 10-8～10-1 进行 系列稀释，并对检出的最低稀释度进行菌落计数。 2 结果与分析 2.1 最 佳 曝 光 交 联 时 间 及 EMA 处 理 浓 度 的 筛 选 结 果 经 终 浓 度 为 1 μg/mL EMA 处 理 的 O157 死 菌 悬 液 ，在 黑 暗 环 境 下 孵 育 5 min 后 ，分 别 曝 光 0、1、2、4、 6、8、10 min 后的 PCR 产物电泳结果如图 1 所示。由图 1 可知，经一定浓度的 EMA 处理后，曝光时间为 1 min 时，即可使其与死菌充分交联。
1000 750 500 250 100
3 4 5 6 7 8 9 10 11
M：DL 2 000 Marker；1： 空 白 对 照 ；2～11：EMA 终 浓 度 分 别为 0、0.2、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL
图 3 EMA 处理 O157 活菌最佳浓度的检测结果
MA 处理含菌量为 0.5 MCF 的 O157 死菌悬液，在黑暗 环境下孵育 5 min 后，曝光 1 min，处理后的 PCR 产物 电泳结果见图 2。 由图 2 可知， 终浓度为 1 μg/mL 的 EMA 即可抑制 O157 死菌 rfbE 基因的扩增。
M 1 2 3 4 5 6 78 bp
2000 1000 750 500 250 100
M：DL 2 000 Marker；1：空白 对 照 ；2～8：EMA 终 浓 度 分 别 为 0、0.2、0.5、1、2、4、8 μg/mL
图 2 EMA 处理 O157 死菌最佳浓度的检测结果
பைடு நூலகம்
M1 2 bp
2000
growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach ［J］.Nature，1999，402（6762）：656-660.
［2］ LORENZI T，MELI R，MARZIONI D，et al. Ghrelin：a metabolic signal affecting the reproductive system［J］. Cytokine Growth F R，2009，20（2）：137-152.
分 别 用 终 浓 度 为 0、0.2、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL 的 EMA 处 理 含 菌 量 为 0.5 MCF 的 O157 活 菌 悬液，黑暗环境下孵育 5 min 后，曝光 1 min，处理后的 PCR 电泳结果见图 3。 由图 3 可知，加入终浓度为 32 μg/mL 的 EMA 样品 PCR 电泳条带明显减弱， 表明终 浓 度 为 32 μg/mL 的 EMA 可 以 显 著 抑 制 O157 活 菌 rfbE 基因的扩增。 2.2 引物特异性检测结果 参照 GenBank 中已发表 的 rfbE 基因序列，设计合成了 1 对用于鉴别 O157 和 非 O157 血清型大肠杆菌及其他种属细菌的特异性引 物。 为了验证该引物的特异性，共选取了包括革兰阳 性和阴性菌在内的 14 种细菌进行了菌液 PCR， 其结
收 稿 日 期 ：2014－09－25 作 者 简 介 ：高 延 玲 （1980— ），女 ，高 级 兽 医 师 ，博 士 ，主 要 研 究
方向为畜产品质量安全检测。 通 讯 作 者 ：班 付 国 （1964— ），男 ，研 究 员 ，硕 士 ，主 要 研 究 方 向
为畜产品质量安全检测。
1.1.1 菌株： 供试菌株共 15 株， 其中阳性对照菌为 EHEC O157，阴性对照菌包括：革兰阳性菌（金黄色葡 萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、单增李斯特 菌）；革兰阴性菌［大肠杆菌 ATCC 25922，肠毒性大肠 埃 希 菌 （enterotoxigenic Escherichia coli enteritis， ETEC）， 肠 道 致 病 性 大 肠 杆 菌 （enteropat hogenic Escherichia coli，EPEC），痢疾志贺菌 ，福 氏 志 贺 菌 ，鲍 氏志贺菌，沙门菌，弗氏枸橼酸杆菌，阴沟肠杆菌，阪 崎肠杆菌］。 对照菌株均由中国兽药监察所兽医微生 物菌种保藏管理中心（CIVBP）提供。 1.1.2 试剂： 叠氮溴化乙锭 （EMA）、Taq PCR Master Mix 试剂盒及细菌基因组 DNA 抽提 试剂盒均 购 自 上 海 莱 枫 生 物 科 技 有 限 公 司 ；LB 培 养 基 购 自 北 京 陆 桥 生物技术有限公司； 琼脂糖、DL 2000 DNA Marker 购 自大连宝生物（TaKaRa）有限公司。 1.1.3 主 要 仪 器 ：温 度 梯 度 PCR 仪 （SENSO），台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 （Sigmas），核 酸 电 泳 仪 （GE），凝 胶 成 像 系统（Gei Doc XR），恒温摇床（Thermo），细菌浊度测定 计购自北京中西远大科技有限公司，EMA 与细菌死细 胞 DNA 分子共价交联装置由河南省兽药饲料监察所 自行研制。 1.2 方法 1.2.1 引 物 设 计 ： 使 用 Primer Premier 5 . 0 软 件 ， 根 据 GenBank 中 已 公 布 的 EHEC O157 rfbE 基 因 序 列 设 计 1 对 引 物 ， 序 列 为 ： 上 游 ： 5 ′ - CAGGT
pcr技术具有快速特异性强等优点但其不能准确地区分样本中的试验建立的emapcr技术结合检测方法能够快速准确地区分样本中的o157eheco157特有的抗原基因rfo157灵敏度检测结果果见图可知以阳性对照菌株eheco15为模板进行的pcr反应获得了条大小约为31bp的条带与目的基因的片段大小相符而其他菌种如金黄色葡萄球菌芽孢杆菌志贺菌等均未出现目的条带
时对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制作用。 EMA-PCR 能有效减少 O157 活菌检测过程中假阳性结果的
出现。
关键词：大肠杆菌 O157；EMA-PCR；检测
中 图 分 类 号 ：Q93-331
文 献 标 识 码 ：A
文 章 顺 序 编 号 ：1672-5190（2014）10-0009-03
肠出血性大 肠 杆 菌 （enterohemorrhagc Escherichia coli，EHEC）O157 是 1 种近年来引起感染性疾 病频发 的食源性病原菌，能在牛肉和未熟透的汉堡包中大量 繁 殖 ， 感 染 后 可 导 致 腹 泻 （Diarrhea）、 出 血 性 结 肠 炎 （hemorhagic colitis，HC）、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrom，HUS）、 血 栓 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 （thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP） 及 其 他 某 些器官和系统的损伤， 甚至导致死亡。 儿童对 EHEC O157 尤其易感，病死率约为 10%，且发生 HUS 后病死 率高达 30% 。 ［1-6］ 2011 年 7 月，美国发生了 EHEC 感染 事件，造成至少 16 人感染，1 人死亡。 据报道，该次感 染 是 由 于 患 者 食 用 了 被 EHEC O157:H7 污 染 的 草 莓 所致［7］。 O157 呈暴发流行趋势，具有强烈的致病性和 致死性，且流行菌株不断发生变异。 目前，针对由其引 起的感染仍缺乏有效的防治方法。 因此，开发快速、特 异性高的检测技术对于该病的早期诊断及疫情的有 效 控 制 至 关 重 要 。 笔 者 通 过 EMC -PCR 结 合 检 测 EHEC O157 方法的建立，以期为探索食源性样本中该 病原菌的分子生物学检测方法提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料
畜牧与饲料科学
Animal Husbandry and Feed Science
2014 ，35 （10 ） ：9-11
ＥＭＡ 与 ＰＣＲ 结合检测大肠杆菌 Ｏ１５７ 方法的研究
高延玲，狄元冉，李金磊，董 鹏，班付国，张发旺 （河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450002）
摘要：为了建立 1 种快速检测样品中大肠杆菌 O157 并能区分死细菌与活细菌的检测方法，将叠氮溴化乙锭