氨基移换实验中纸层析方法的改进研究

氨基移换实验中纸层析方法的改进研究
刘美艳;营孙阳;张健;朱爱华
【摘要】由于传统氨基移换实验中的展层剂水饱和苯酚是有毒物质，寻找低毒或无毒的展层剂是十分必要的。

文章通过对展层剂的种类、配比、展层时间及染色方法的研究，确定了以正丁醇：甲酸（88％）：水为15：3：2的展层剂，展层时间为1．5h，以展层剂为溶剂的0．3％茚三酮为染色液，并使展层与染色同步进行。

%The traditional chromatographic solution in the experiment of paper chromatography of amino transfer and exchange was saturation phenol which was toxic. It is necessary to find chromatographic solution which was low toxic or non-toxic. This paper investigates the chromatographic solutions, proportion, chromatographic time and staining method. The results showed that the suitable chromatographic solution was n-butanol, formic acid and water, and corresponding proportion is 15: 3: 2. The suitable chromatographic time was 1.5h. The staining solution was 0. 3 % ninhydrin which solved with chromatographic solution, and chromatography and staining were synchronous.
【期刊名称】《实验科学与技术》
【年(卷),期】2012(010)006
【总页数】3页(P21-22,37)
【关键词】氨基移换;纸层析;展层剂;染色
【作者】刘美艳;营孙阳;张健;朱爱华
【作者单位】江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116
【正文语种】中文
【中图分类】Q5;Q503
纸层析法是分离混合氨基酸的常用方法。

“氨基移换作用(纸层析法)”是大中专院校生物化学实验中的一个基础实验。

该实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，验证组织内氨基移换作用。

实验结果要求能够清晰地鉴定出丙氨酸和谷氨酸。

传统实验中，通常用苯酚做展层剂，虽然实验效果较好，但苯酚是一种有毒物质，对皮肤有较强的腐蚀性，对人体毒性较大，而且价格较贵［1－3］。

层析完毕后，用茚三酮溶液喷雾显色，经常会由于喷雾不均，造成显色不均，从而影响实验效果［4－5］。

在多年的教学实践中，我们对展层剂进行了筛选，对显色步骤进行了简化，使实验方法节约环保、简单易行，实验效果明显。

1 材料与方法
1.1 实验材料
乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、95乙醇、无水乙醇、甲醇、正辛醇、去离子水、冰乙酸、盐酸、88甲酸、苯酚、0.5丙氨酸和0.5谷氨酸的等量混合液、0.1，0.3，0.5茚三酮无水乙醇溶液;直径为18 cm的圆形滤纸、滤纸条、毛细管(0.3
mm×100 mm)、直径为14 cm的培养皿。

1.2 实验方法
1.2.1 点样
取18 cm圆形滤纸，在中心用圆规画一半径为1 cm的圆，在圆上平均标出4点
作为点样点，每个点用丙氨酸和谷氨酸的等量混合液重复点样4次。

在滤纸中心
处打一小孔(铅笔芯粗细)，再取条状滤纸(3 cm×4 cm)卷成灯芯状，插入滤纸中心孔中，把展层剂放入培养皿中，把滤纸平放在培养皿上，使纸芯下端浸入层析剂中，盖上培养皿盖，放入层析柜中展层。

展层结束后，去除纸芯，用吹风机将滤纸吹干。

1.2.2 展层剂的筛选
以乙酸乙酯、甲醇、乙醇(95)、正丁醇、正辛醇、氯仿作为展层剂中的非极性相;
水作为极性相，甲酸(88)、乙酸、盐酸调节酸度且具有防止拖尾的作用;以水饱和
苯酚为对照，将上述3类物质组合成不同的展层剂，通过大量实验筛选最佳的展
层剂组合，在此基础上对3类物质在展层剂中的比例及展层时间进行了研究。

1.2.3 染色方法的选择
传统染色方法是展层结束后，用茚三酮乙醇溶液均匀喷洒，吹风机吹干显色。

我们以展层剂为溶剂，配制不同浓度的茚三酮展层剂显色液，将展层与显色同步进行，展层结束后，吹风机吹干直接显色。

2 结果与讨论
2.1 展层剂筛选
以乙酸乙酯、甲醇、乙醇(95)、正丁醇、正辛醇、氯仿作为展层剂中的非极性相;
水作为极性相，甲酸(88)、乙酸、盐酸调节酸度且具有防止拖尾的作用;以水饱和
苯酚为对照(见图1)，将上述3类物质组合成不同的展层剂，通过大量实验确定了正丁醇∶甲酸∶水的组合。

图1 水饱和酚作为展层剂的层析图谱
2.2 展层剂比例的选择
以正丁醇∶甲酸∶水的4种不同比例(15∶3∶1;15∶3∶2;15∶3∶3;15∶3∶4)作
为展层剂，分别展层1 h，1.5 h，2 h，采用先展层后染色的传统方法，实验结果
见图2。

计算图2中各样品的相对迁移率，结果见表1。

由图2可见，当展层剂配比为15∶3∶1时，无法将样品中两氨基酸分开;其他配比
条件下都可以将样品中两氨基酸分开;对比层析效果可以看出，当展层剂配比为
15∶3∶2，展层时间为2 h时效果最好。

从表1各样品相对迁移率的差值可以看
出，展层剂正丁醇∶甲酸∶水为15∶3∶2、15∶3∶3 和15∶3∶4时，在展层时
间相同的条件下，样品中两氨基酸的相对迁移率差值均是15∶3∶2最大，
15∶3∶4最小;在展层剂配比不变的条件下，展层时间越长分离效果越好;当展层剂
配比为15∶3∶2，展层时间为2 h时相对迁移率差值最大，说明样品中两氨基酸
分开越明显，展层效果越好。

由于受实验课时的限制，在保证展层效果的前提下，
我们选择的最佳展层剂配比为15∶3∶2，展层时间为1.5 h。

图2 不同配比的展层剂及展层时间的层析图谱
图3 不同茚三酮浓度下先展层后染色的层析图谱
图4 不同茚三酮浓度下展层与染色同时进行的层析图谱
表1 不同展层条件下的各样品相对迁移率/RfRf正丁醇∶甲酸∶水氨基酸1 h 1.5
h 2 h 15∶3∶1 谷氨酸－－－丙氨酸－－－15∶3∶2谷氨酸
0.342 0.364 0.444丙氨酸 0.446 0.470 0.557 Rf丙－谷0.104
0.105 0.113 15∶3∶3谷氨酸 0.372 0.379 0.470丙氨酸 0.472 0.481 0.576 Rf丙－谷0.100 0.102 0.106 15∶3∶3谷氨酸 0.368 0.377 0.480丙氨酸 0.454
0.470 0.578 Rf丙－谷0.086 0.093 0.098
2.3 染色方法
以正丁醇∶甲酸∶水=15∶3∶3为展层剂，展层1.5 h，分别采取先展层后染色(图
3)和展层与显色同时进行的方法(图4)。

从图3和图4中可以看出，随着茚三酮浓
度的增加颜色逐渐变深，当茚三酮浓度为0.3时，效果已经比较明显。

展层与显色
同时进行，操作起来较简便易行，因此，以展层剂为溶剂配制成0.3的茚三酮展层
显色液，展层后吹干直接显色是简便且有效的方法。

3 结论
通过多年的实践教学，寻找到了能代替水饱和酚溶液进行展层的展层剂配比正丁醇∶甲酸∶水为15∶3∶2，既能保证实验效果，又解决了水饱和酚有毒有可能对人体和环境带来危害的问题。

随着展层时间的延长，展层效果越来越明显，但由于实验教学的内容大多要求在一个上午或者下午完成，所以展层时间为以1.5 h为宜。

以展层剂为溶剂的0.3茚三酮展层显色液采取展层与染色同步进行的方法，既节约了步骤又能缩短实验的时间，且染色效果良好。

参考文献
【相关文献】
［1］白玲，黄健.基础生物化学实验［M］.上海:复旦大学出版社，2004:137－139.
［2］罗德生，刘红梅，李映红，等.生物化学与分子生物学实验教程［M］.北京:科学出版社，2007:83－85.
［3］王筑婷，吴青青．圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进［J］.贵阳医学院学报，2008，
33(4):418－419.
［4］榻金彩，周桂．对植物体内的转氨基作用实验的改进［J］.生物学通报，2006，41(1):50－51.
［5］田明，高铮，苏英华，等．氨基酸纸层析实验的进一步探讨［J］.实验室科学，2009，
28(6):64－65.。