精子功能检测在辅助生殖中的应用

精子功能检测在辅助生殖中的应用
曹泽磊，朱亮（中国人民解放军第306医院生殖医学中心，北京，100101）
摘要：精子功能检测在男性不育的诊断和治疗中的作用越来越引起人们的重视。

目前精液检测的技术和方法很多，如对精子运动特征检测、形态学分析、体外存活试验、精子膜完整性试验、顶体状态测定、精子－宫颈黏液相互作用试验等。

这些试验均为男性不育症的诊断提供帮助，但各个检测项目的结果对体内外生育能力的预测有所差异，因此有必要结合临床实际对检测项目进行必要地筛选，既能为临床诊断提供依据，又可提高效率节约患者的医疗成本。

关键词：精子功能；辅助生殖；筛选
中图分类号：R446.144文献标识码：B文章编号：1006－9534（2011）01－0136－03
Sperm function tests in assisted reproduction．CAO Ze－lei，ZHU Liang．（Department of Reproductive Medicine，the306th Hospital of P．L．A．Beijing100101）
Abstract：Human sperm function test has such an essential role on the etiologic diagnosis of male infertility that it attracts more and more attention．Many tests have offered indispensable approaches to diagnose the male infertility such as sperm movement charac-ter，morphological analysis，survival test in vitro，integrity of sperm membrane，acrosomic status，interaction between sperm and cervical mucus and so on．We should select them to apply the clinical and to reduce the costs．
Key words：Sperm Function；Assisted Reproduction；selection
在男性不育的诊治过程中，精液的常规化验分析一直作为一个很重要的参考指标，来指导临床的治疗方案，随着男科学研究的深入，传统的精液分析已不足以对男性生育能力进行准确评价。

精液常规检查可了解精液、精子和精浆的一般性状，精子功能评价则是检测精子执行某个特定功能的状态。

研究表明，精液常规分析与实际生育力的一致性仅有70%［1］。

因此，在常规精液检查的基础上，还需借助一系列相关的精子功能检测来了解男性不育的可能病因和综合评价男性生育潜力。

现就当前有关在在辅助生殖中应用的精子功能的检测方法予以综述，并结合临床实际，筛选必要地检查项目应用于辅助生殖的治疗过程中。

1．精子运动功能的检测
精子活动能力已经被作为精子受精的重要指标，客观而准确地分析精子活力在男性不育的临床诊断中占有极为重要的地位。

在我国，目前临床上仍推荐由训练有素的检验人员严格按照WHO编辑的《人类精液及精子一宫颈粘液相互作用实验室检验手册》进行精子活力及活率的测定。

但这些测定往往带有一定的主观性、重复性差等不足。

目前，已发展了一系列客观评价人类精子活力及其运动特征的新技术，如采用浊度分析法、激光散射测量仪、显微摄像术、连续分步曝光照相术、计算机辅助的精液分析（CASA）技术等。

其中，以CASA技术受到普遍重视，该法较人工法具有两个优点：①高精确度；②提供精子动力学的量化数据［2］。

因此，当前仍推荐以直接目测法来判断精子群体活力及其活动精子百分率，使用血球计数板来测定精子数，如果将CASA系统纳入临床应用，要特别注意指控和定期与人工分析结果进行对比，缩小误差。

2．精子形态学分析
精子形态的检测对精母细胞和生育力是一个敏感的指标。

体外受精研究表明，正常形态精子比率与受精率呈正相关，畸形精子很少能结合到卵透明带上。

常见的精子功能缺陷是精子的形态异常，而大部分畸形的精子都是顶体异常，圆形无顶体的精子可以确定为完全不育［3］。

精子形态学分析以精子涂片染色为基础。

世界卫生组织（WHO）从精液分析手册的第1版（1980）至第4版（1999），一直优先推荐改良巴氏染色法应用于人类精子染色［4］。

其它常用的有HE（苏木精一伊红）染色法或瑞一姬氏染色法对染片进行精子形态学分析。

目前普遍采用的评定标准是严格的形态学测定方法［5］。

对于IVF的受精率有很大的意义。

精子形态异常主要与精子功能有关，大部分畸形精子都是由于顶体异常［6］。

而顶体异常的精子很难结合和穿透卵子的透明带，从而导致受精失败。

过去临床上诊断为不明原因不育症的患者，其中很多患者实际上是由于畸形精子率高而导致受精率低或受精完全失败。

3．精子体外存活试验
精子存活是精子执行功能活动的基础，并以运动显示存活。

无论在体内或体外，精子必须存活一定时间才能进入超激活运动状态、经历获能等受精前的一系列生理变化，因此寿命越长的精子与卵子相遇的机会越多。

检测精子存活有3种实验形式［7］：（1）体外培养法；（2）直接观察法；（3）宫颈粘液法。

体外培养法将精子从精浆中分离出来，可相对准确地检测精子存活时间的动态改变，但试验需应用培养箱和培养液等设备及试剂，基层检验室不便开展。

直接观察法简单方便，但精液性状如粘稠度高、pH偏高或偏低，精液中各种细胞类群包括白细胞，都对精子存活有较大的影响。

宫颈粘液法避免了离心对精子损伤，且宫颈粘液是精子合适的介质，但试验受制于宫颈粘液标本来源。

4．精子膜完整性试验
精子膜是精子最外层的细胞结构，它的结构与生理的完整性对精子运动、生化代谢和维持存活是具有重要作用［8］。

其功能的完整性是评价男性生殖力的重要指标［9，10］。

精子膜主要分为头部膜和尾部膜。

评价精子头膜的完整性试验
多借助染料，依据精子核着色与否来判定精子头膜的完整性。

如伊红法、锥蓝法和Hoechst233258超活荧光染色法，这类检测亦称精子活体染色试验。

对精子尾膜完整性检测可采用低渗液进行，如Jeyendran等［11］进行的精子尾膜低渗肿胀试验。

朱伟杰等建立伊红拒染一低渗肿胀（excluding eosin Y－hypoosmotic swelling，EY－HOS）结合试验，可以对单个精子头部和尾部膜完整性同时测试，实验证实精子头膜与尾膜的损伤是独立发生的，尾膜完整并非说明头膜也是完整，尤其是冷冻精子、附睾精子和高畸形精子率标本，头膜损伤一尾膜完整的精子有相当比例［12，13］“。

EY—HOS试验避免了仅伊红法或仅尾膜低渗肿胀试验只显示精子一个部位膜状态的局限性，提高了测试准确性。

5．精子顶体状态和顶体反应测定
顶体是精子头部的膜相帽状结构对精子与透明带结合和穿透起决定性作用，没有顶体的精子，不能与卵子透明带和胞质膜结合，在常规IVF过程中，也不能受精。

目前通过ICSI可以使这类精子获得受精卵，但是受精率，胚胎发育及植入率仍然很低。

因此，准确的检测顶体状态显得尤为重要。

主要应用顶体特异性染色的测定，常用方法有单克隆抗体免疫荧光标记法、三色染色法、植物凝集素荧光标记法等，其中豌豆凝集素荧光标记法（pisum sativnm agglutinin，PSA）简便可靠［14］。

豌豆凝集素标记在整个精子顶体的基质，在荧光显微镜下容易观察，且很稳定，结果准确重复性好。

目前体外可用孕酮和钙离子载体诱发顶体反应。

孕酮诱发的顶体反应的百分率很低，而且精子需要很长时间（8 20h）的获能培养，这样会导致结果的不稳定。

用钙离子载体诱发顶体反应可帮助预测精子在体外的受精能力，尤其是对精子计数和活动率正常但正常精子形态率低的患者。

此外，还可通过检测可反映顶体酶全部活性的存在于精子顶体的精氨酸酰胺酶来确定顶体酶的活性。

其原理是精氨酸酰胺酶以Na－苯甲酰－DL－精胺酸－p－硝酰基苯胺（BAP-NA）为底物，分解产生有色产物一硝酰基苯胺，通过测定硝酰基苯胺的产量可推算出精氨酸酞胺酶的活性，从而反映顶体酶的全部活性［15，16］。

6．精子－人卵透明带结合试验
正常具有受精能力的精子只有与卵透明带结合，并由卵透明带诱发顶体反应，直到精子穿过透明带并与卵黄膜结合方能完成受精，因此在临床上应用精子－人卵透明带结合试验便显得很有意义，但本试验受人卵透明带来源制约而难以广泛开展。

一直有研究者试图解决人卵来源的困难，例如通过基因重组分子生物学技术合成人透明带糖蛋白，但合成的糖蛋白没有生物活性［17，18］。

这项试验主要有两种形式：精子－透明带结合比率试验和半透明带试验。

该试验与精子顶体完整率、正常形态精子率呈正相关，并且能预示体外受精能否成功。

另外，目前还有一种以上方法的延伸实验：精子－透明带穿透实验。

该实验是把结合在透明带上的精子用毛细管吹打下来后，再计数透明带上不能吹打下来的精子。

这些精子都是精子头的部分或全部穿进了透明带的，不会被吹打下来，但该实验对卵子的要求比较高，必须是新鲜的，且没有与精子反应过的未成熟卵子。

7．精子－去透明带地鼠卵穿透试验
人精子－去卵透明带地鼠卵穿透试验（sperm penetra-tion assay，SPA）的原理是基于金黄地鼠卵去除透明带后几乎不再具有种属特异性的特点，然后根据人精子穿透地鼠卵的情况来评价其受精能力。

SPA可以测试人精子经历获能、顶体反应、体外与去透明带地鼠卵融合的能力，是评价精子受精潜力的一个有效动物模型。

超微结构研究证实，发生顶体反应时，人精子赤道环的浆膜所启动的卵膜融合与SPA的精－卵融合过程是相同的［19］。

但是该试验易受多重因素影响出现“假阳性”和“假阴性”等结果，因此进行SPA时，必须同时进行质量控制，对穿卵率也须结合临床作出解释。

8．精子－宫颈黏液相互作用试验
精子－宫颈黏液相互作用试验是证明精子是否有能力在宫颈黏液迁移的试验，可了解精子穿透密度、迁移距离、迁移密度减少程度等多项参数，而且可在宫颈黏液中观察精子一定时间的存活状态，WHO手册4次颁布都将该试验作为不育症全面检查的一项重要指标。

精子在宫颈黏液中的迁移与正常形态精子率有明显关系，Katz等［20］研究表明，形态异常精子在宫颈粘液中泳动速度显著低于形态正常精子。

该试验分体内试验和体外试验。

体内试验即性交后试验（PCT）。

体外试验主要包括玻片试验、毛细管试验和精子一宫颈粘液接触试验。

毛细管试验操作简便，实验条件易控制，影响因素少，该试验还可以用来鉴别导致PCT结果异常的因素是在男方还是女方，具有很大的临床实用价值。

玻片试验的原理和作用类似毛细管穿透试验，区别在于此法在载玻片上直接观察精子对宫颈粘液的穿透，比毛细管法更为简便［21］。

9．精子核成熟度及DNA完整性检测
精子核主要由鱼精蛋白及DNA构成。

精子是在附睾成熟的，精子核在此成熟过程中经历了结构和生化的变化，精子核与鱼精蛋白之间的二硫键形成可使精子核DNA稳定性增加，核成熟度差及DNA损伤的精子会导致受精失败［22，23］。

检测精子核成熟度的简便方法有：①苯胺蓝染色检测：不成熟的精子核被染成深蓝色，而成熟的精子核不着色；②啶橙诱发荧光试验：不成熟的精子核不稳定，易变成类似于单链的结构，被染成橙红色，DNA双链和核成熟的精子染成绿色。

须注意的是：测定精子核成熟度时，检测活动精子的精子核成熟度才更具有生理学意义。

目前常用的男性不育临床检测项目尚不能反映精子DNA 损伤的情况。

因此，精子DNA完整性检测成为男性不育临床检测的新选择，尤其是染色体扩散试验（sperm chromatin diper-sion test，SCD），因其检测快速、费用低廉而备受推崇。

10．精子悬浮液活性氧测定
活性氧（reactive oxygen species，ROS）在男性生殖中的作用近年来受重视的程度越来越高，不仅是由于其与精子高活跃性运动、获能及顶体反应等生理功能有关，而且还与精子膜脂质过氧化损伤、精子活力降低及DNA氧化损伤等病理过程有密切联系。

适量的ROS可以防止精子运动功能的丧失，但过高的ROS则对人类精子运动有直接的抑制作用，并与精子内三磷酸腺苷的耗竭有关［24，25］。

目前ROS的检测主要通过使用灵敏的照度计（如Berthold LB9505）和化学发光探针来实现。

除此之外，也可用其他探针，包括被认为能
检测细胞外释放阴离子的光泽精以检测洗涤后的人精子产生的ROS。

综上所述，要全面评价精子功能检测对不育症的诊断意义，必须进行精子的各项功能综合检测。

但是鉴于各种检测方法的应用条件及临床实际并非所有的检测手段都能应用于基础临床实际，因此建议适合临床开展的检测项目有精子运动特征检测、形态学分析、体外存活试验、精子膜完整性试验、顶体状态测定、精子－宫颈黏液相互作用试验以及精子－去透明带地鼠卵穿透试验，其他项目根据实际情况有条件的中心开展。

随着对男性生殖学中不育症的深入研究，以及新的检测方法不断发展，有关精子功能检测的实验手段将会更加完善的应用于辅助生殖技术中，更好的解决男性的不育问题。

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收稿日期：
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2010－04－15
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收稿日期：2010－07－21。