牛睾丸原代细胞的培养技术与大容量批量冻存试验
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ｅ Ａ ，． 胰 蛋 白 酶 ＋ ０ ０ Ｅ ＴＡ 以 及 ２ ５ ＤＴ ５ ０ ． ２／ Ｄ ９ ５ ．
苗 的 牛睾丸 约 为 ７ ０万 对 ， 牛 的产仔 具有 相对 严格 但 的季节 性 ， 同一 个 牛 场 每 天 的睾 丸 产 量 是极 其 有 且 限的 。这 给疫 苗生产 厂家批 量 收集睾 丸 以及 调剂生 产周 期等方 面 带来 了 困难 。另 外 ， 常不 断 的从 外 经
牛 睾丸 原代 细胞 是 目前 生产 细胞 型猪瘟 弱毒 疫 苗 的最 主要 细胞 源 。全 国每年用 于生 产猪 瘟弱 毒疫
１ ３ １ 试 验设计 选 择 ３对牛 睾丸作 为试 验对 象 ， ．． 分别用 含有 Ｈａ ｋＳ液 的 ２ ５ 胰 蛋 白酶 ＋０ ０ ｎ ． ． ２４ ， ｏ
培 养液 样 品 ， 血球计 数板 计数 。
３２
中 国兽 医杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 卷 ） １ 第 ８ 第 期
Ｃ ｉｅｅ ｏ ｒａ ｏ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｕｎ１ ｆＶｅｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ ｎ ｉ
２１ ０ 河 南信 阳 中小 型 猪 场 大肠 杆 菌病 ０年 血 清 型调 查 报 告
猪 大肠 杆菌病 是 由致病 性大 肠杆 菌引 起 的仔猪
冰箱 。
的一组 肠道 传染性 疾 病 ， 见 的有仔猪 黄痢 、 猪 白 常 仔
痢 和仔 猪水 肿 ３种 。 以发 生肠 炎 、 肠毒 血症 为特 征． 主要 发生在 Ｏ ０日龄 的仔 猪 。大肠 杆 菌病属 于条 ～７ 件 性 致病 菌 ， 当环境 因素恶 劣 或机体抵 抗 力下 降时 ， 容 易 引发该 病 的发 生 ， 其 是 冬季 ， 气寒 冷 ， 温 尤 天 气 剧变 ， 保温 不 良， 空气 流通 不 畅 ， 更易 引发 此病 ， 造成 新生 仔猪 大批 死亡 或 生 长发 育 不 良 ， 重 影 响 养 猪 严 业 的发展 ， 养猪户 造成 巨大 的 经济 损失 。２ １ 给 ０ ０年 ２月到 １ １月期 间 ， 我们 对 信 阳地 区存 栏 母 猪 在 １ ０ ０
３ ℃水 浴锅 中消化 ３ ｎ 在 超 净工 作 台 内慢 慢 将 ７ ０ｍｉ ， 消化 液 倒 出 ， 向瓶 中加 入 ＤＭＥ 工 作 液 进 行 中 再 Ｍ 和 ， 去培 养基 ， 烈振 摇 ， 消化 后 的睾 丸 细胞 充 倒 强 使 分从 组织块 上分 离 出来 ， 用培 养基 冲洗 玻璃珠 ， 再 洗 液 即成为 细胞 悬 液 ， 入 细 胞 瓶 中 ， 人 ３ 倒 放 ７Ｃ二 氧 化碳 培养箱 培 养 。
胞袋 解冻 离 心 后 轻 轻 移 入 超 净 工 作 台 内倒 出 上 清
ＤＭＥ 高糖 培养基 原液 ， 自北京 清大 天一 科 技有 Ｍ 购
限公 司 ， 液按 使用 说 明 书 配 制 ， 加 入 １ 血 清 原 另 ０ 即成 为 ＤＭＥ 高 糖 工 作 液 。细 胞 冻 存 液 由 ４ Ｍ ５／ ９ ６
１ ５ 分离 培养 病料 分别 接种 普通 营养 琼脂 平板 、 ． 鲜血琼 脂 平 板 、 康 凯 平 板 ， ３ ℃ 培 养 ２ ； 麦 置 ７ ４ ｈ 涂 片 ， 兰染 色镜 检 ， 取 培养 基 上 的典 型 单个 菌落 ， 革 挑 依次 接种 于麦康 凯琼 脂平 板 、 肉汤 ， 进行 纯培养 。 １ ６ 生化 试验 取 纯培 养菌 落接种 生 化反应 管 ， ． 于
头 以下 的 中小型养 猪场 开展 了猪 大肠杆 菌病 血清 型 流 行病学 调查 工作 。
１ 材 料 与 方 法
ｍｉ ； 其上 清液 ， ０ ／ ｎ离 心 １ ｎ 取 其 沉 ｎ取 ８０ ０ｒｍｉ ０ｍｉ； 淀 物配 成 菌 悬 液 ， 经 １ １℃ 处 理 ２ｈ 破 坏 Ｋ 抗 再 ２ ， 原， 即为 Ｏ抗 原 ； ℃保 存 ， 用 。按 照 大 肠 杆 菌 标 ４ 备
１０ ０ｍＬ， ３ 。下 转瓶 培养 。对 照组 按 传 统方 法 ０ 于 ７Ｃ 进 行解 冻培养 。
１ ５ 细胞存 活率 检 测 细胞 悬 液 和 台 盼 蓝染 液 按 ． １： （ ： 的 比例 混 合 ， 色 ２ ３ｍｉ １ Ｖ Ｖ） 染 ～ ｎ后在 倒 置
显微 镜下 用血球 计 数 板进 行 细 胞 计数 ， 区分 出活 并
１ 材 料 与 方 法
好 的去 皮睾 丸 称 重 ， 后 将 睾 丸 组 织 剪 成 厚 约 ０ ２ 然 ． ｃ 的碎 片 ， 入一个 装有 玻璃 珠并 经高 温灭 菌处 理 ｍ 转
的抽滤 瓶 中 ， 继续 向抽 滤瓶 中加 入 细 胞 消化 液 直 至
浸 没全 部 玻 璃 珠 及 其 上 放 置 的 睾 丸 组 织 ， 置 于 放
１１ 试 验 试 剂 ．
Ｈａ ｋ Ｓ液 ： 标 准 配 方 自配 。 ｎ 按
１ ４ 冻存 与解 冻操作 当睾 丸细胞 分离 后 ， 照 每 ． 按 ３ ５ｇ睾 丸组织 加 入 ２ ０ｍＬ冻存 液 的标 准制 成 细 ． ０
胞悬 液 ， 装入 冻存袋 中 ， 分 每袋 ２ ０ｍＬ， ０ 将其 分别 放 入一 适 当大小 的泡 沫 箱 内和 铁盒 内 ， 放 入 ～８ ℃ 并 Ｏ 的冰 箱 中让其 自然 冻结 。另取 少量 细胞 悬液放 人 若 干个 冻存 管 ， 照 常规冻 存方法 作检 测备 用样 品 。 按 分别 在细 胞冻 存 后 的 第 ３ 、 ２ 、 ６ Ｏ １ Ｏ ３ ０天 取 部 分 细胞 进行 解冻 。将 泡沫 箱 内的细胞 袋 和铁盒 中的细
２０ 。 ２ 份
准 抗 Ｏ血 清 凝 集 试 验 使 用说 明 书操 作 。鉴 定 发 病
场 猪大 肠杆 菌致病 菌株 血清 型 。
１ ８ 致 病性 试验 将 鉴 定 的大 肠 埃 希 氏 菌分 别 接 ． 种 于 营养 肉 汤 培 养 基 ，７Ｃ振 荡 培 养 ， ０ ／ ｎ ３。 ４０ ０ｒ ｍｉ 离 心 ２ ｎ 用等 量灭 菌 生理 盐 水 配制 悬 浮 液作 攻 Ｏｍｉ ， 毒 用 。将 ２ ７只 小 鼠 ， 为 ９组 ， 组 ３只 。８个 组 分 每 为试验 组 ， 个 组作 为对 照 ， 验 组 腹腔 注 射悬 浮 液 １ 试
收 稿 日期 ：０ ０１—２ ２ １ ～２２ 基 金 项 目： 汉 市 财 政 局 创 新 岗位 项 目（ ｃ２ ０ ０ ０ ３ 武 ｙｘ ０ ９ １ １ ） 作 者 简介 ： 向敏 （９ １） 女 ， 医 师 ， 士 ， １８～， 兽 硕 主要 从 事 细 胞 培 养 和 病 毒检 测研 究 ， — ｉ ｍｌ ６ ９ １ ６ ｃｒ Ｅ ｍａｌ ：ｘ １ ０ ＠ ２ ．ｏ ｎ
３ ℃培养 ， ７ 按说 明 书进行 生化 反应试 验 。
１ ７ 血 清型 鉴定 将经 生 理 生 化 试 验鉴 定 为 大 肠 ． 杆 菌的纯 培养 菌 株 于普 通 琼 脂 培 养 ， ２ｍＬ ． 用 ０５
石 碳酸 生理 盐 水 洗 下 以后 ， ２ ０ ０ ｒ ｍｉ 以 ０ ／ ｎ离 心 ５
１１ 病 料 采 自 ２ １ ． ０ ０年 以来 河南 省信 阳地 区平 桥 区 、 河 区 、 山县 、 山 县 、 狮 ’ 罗 光 固始 县 、 川 县 、 县 潢 新
１ ６ 发 生猪 大肠杆 菌病 的 中小 型 养 猪场 ； 中 ， ５个 其 肛 门拭子 １ ０份 ， 猪空 肠和小 肠 内容物 ｌ Ｏ份 ， 计 ２ 病 Ｏ 共
液， Ｄ 用 ＭＥ 工 作 液 重 悬 细 胞 ， 样 计 数 ， 重 悬 Ｍ 取 将
细胞 液 导 入 １ ０ ０ ０ ０ ｍＬ 的 转 瓶 中 ， 加 培 养 基 至 补
手手 指 尖离切 口约 ｌｍ 处 结 扎 ， ｃ 用浸 满 碘 酊 的棉 花 条沿 切 口向后 将整 个 阴囊包 裹 ， 入采 样袋 中 ， 人 装 放 装有 冰 袋 的泡 沫箱 内存 放备 用 。 １ ３ 原 代细 胞 制作 ．
皮， 继续 用 含 双 抗 的 Ｈａ ｋ Ｓ液 洗 涤 １ ２次 ， 洗 ｎ ～ 将
于生 产猪瘟 疫 苗 的牛睾 丸细胞 最好 是经 检测 无污 染 并能 产 出高效 价 病 毒 的合 格 细 胞 。但 是 ， 睾 丸 细 牛 胞传 代次 数是 有 限 的 。统 计 数据 表５代 次＿ 。很 明 显 ， ］ ］ 以现 有 的冻 存 管冻存 技 术 冻存 牛 睾 丸 细胞 等 待 检 测 结果 ， 再将 其解 冻用 于 大容 量 转 瓶 培 养 是不 可 能 的 ， 只有 采 取大 容量批 量 冻存技 术建 立可 靠 的健 康 牛睾 丸原 代 细胞贮 备库 才 可 以做 到这 一点 ， 目前 ， 内外 尚无 国 类 似 的成熟技 术 。本试 验 从 传 统 制作 方法 的改 进 ， 胰 酶 的消化 以及 大容量 批量 冻存 等方 面改 进牛 睾丸 细 胞 的原代 培养 技术 ， 研 究猪 瘟 细 胞 型 弱毒 疫 苗 为 的规 范化生 产 ， 提供技 术参 考 。
界送 入生鲜 睾 丸组 织 ， 加 了药 品生 产 质 量 管 理 规 增 范（ ＧＭＰ 车间 的污染 频率 ， ） 因此 ， 入 ＧＭＰ车 间用 进
胰蛋 白酶 三种不 同消 化方 法分 离牛 睾丸 细胞 。 １ ３ ２ 操 作方 法 从样 品袋 中取 出阴囊 ， ．． 在超 净工 作 台 内无 菌操 作 ， 眼科 镊 子 夹住 露 于 阴囊 切 口外 用 的附睾或 睾 丸 系 膜 组 织 ， 睾 丸 放 入 盛 有 Ｈａ ｋ Ｓ 将 ｎ 液 的平皿 中 ， 含有 双 抗 的 Ｈａ ｋ Ｓ 反复 洗涤 ， 用 ｎ 液 再 将 睾丸放 入另 一 干燥 平 皿 内， 眼科 剪 剪 去 睾 丸 表 用
ＤＭＥ 原液 、 ５ 新 生 牛 血 清 、 Ｏ Ｄ Ｍ ４ １ ＭＳ 混合 均 Ｏ 匀制 得 。分 别 装 入 ２ ０ ｍＬ血 清 袋 中 ， Ｋ ０ ８ ＧＹ 剂 量
下辐 照 ５ｈ 一２ ℃冻存 备用 。 ， Ｏ １ ２ 牛 睾丸 的采集 刚 出生 的奶 公牛 ， ． 运入 洁净 手 术室 ， 照常规 操作 快速 将 阴囊皮 肤环切 ， 按 同时切 断 皮下 筋膜 、 睾 、 管 等 组 织 ， 一 根细 绳 在 术 者 两 附 血 用
刘 涛 ，王 瑞 ， 曲哲 会 ，连 慧 香 ，魏 爱枝
（ 阳 农 业 高 等 专 科 学 校 ， 南 信 阳 ４ ４０ ） 信 河 ６ ０ ０
中图 分 类 号 ：８ ２ ６ 。 ￥ ５ ． １。 ２
文 献 标 识 码 ： Ｂ
文 章 编 号 ：５ ９６ ０ （ ０２ ０ —０ ２０ ０ ２ —０ ５ ２ １ ） １０ ３ —２
细胞 和死 细胞 以计算 细胞 活力 。 １ ６ 细胞 贴壁 率检 测 及 细 胞形 态学 观 察 转 瓶培 ． 养 ８ｈ后 ， 在转 瓶 显 微 镜 下 观察 细 胞 形 态 并 取 少 量
通讯作者 ： 高其 双，Ｅ ｍａｌｇｏ ｉ ｕｎ ５ ８ ｉａｃ ｍ — ｉ：ａｑｓ ａ ｇ １ ＠ｓ ．ｏ ｈ ｎ
３ ０
中 国兽 医杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 第 ８卷 ） １ 第 期
牛 睾 丸原 代 细胞 的培 养 技 术 与大 容 量 批量 冻 存 试 验
向 敏 ，陈 志 华 ，高其 双 ，黄 海 军 ，陶 弼 菲 ，占才耀 ，王连 芳 ，李 杰
（ 北 省 武 汉 市 畜牧 兽 医科 学 研 究 所 ， 北 武 汉 ４ ０ ６ ） 湖 湖 ３０ ５ 中图 分 类 号 ： ９ Ｑ２ １ 文 献标 识 码 ： Ｂ 文 章编 号 ：５ ９６０ （０ ２ ｏ一０ ００ ０ ２—０ ５ ２ １ ） ｉ０ ３—２
苗 的 牛睾丸 约 为 ７ ０万 对 ， 牛 的产仔 具有 相对 严格 但 的季节 性 ， 同一 个 牛 场 每 天 的睾 丸 产 量 是极 其 有 且 限的 。这 给疫 苗生产 厂家批 量 收集睾 丸 以及 调剂生 产周 期等方 面 带来 了 困难 。另 外 ， 常不 断 的从 外 经
牛 睾丸 原代 细胞 是 目前 生产 细胞 型猪瘟 弱毒 疫 苗 的最 主要 细胞 源 。全 国每年用 于生 产猪 瘟弱 毒疫
１ ３ １ 试 验设计 选 择 ３对牛 睾丸作 为试 验对 象 ， ．． 分别用 含有 Ｈａ ｋＳ液 的 ２ ５ 胰 蛋 白酶 ＋０ ０ ｎ ． ． ２４ ， ｏ
培 养液 样 品 ， 血球计 数板 计数 。
３２
中 国兽 医杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 卷 ） １ 第 ８ 第 期
Ｃ ｉｅｅ ｏ ｒａ ｏ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｕｎ１ ｆＶｅｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ ｎ ｉ
２１ ０ 河 南信 阳 中小 型 猪 场 大肠 杆 菌病 ０年 血 清 型调 查 报 告
猪 大肠 杆菌病 是 由致病 性大 肠杆 菌引 起 的仔猪
冰箱 。
的一组 肠道 传染性 疾 病 ， 见 的有仔猪 黄痢 、 猪 白 常 仔
痢 和仔 猪水 肿 ３种 。 以发 生肠 炎 、 肠毒 血症 为特 征． 主要 发生在 Ｏ ０日龄 的仔 猪 。大肠 杆 菌病属 于条 ～７ 件 性 致病 菌 ， 当环境 因素恶 劣 或机体抵 抗 力下 降时 ， 容 易 引发该 病 的发 生 ， 其 是 冬季 ， 气寒 冷 ， 温 尤 天 气 剧变 ， 保温 不 良， 空气 流通 不 畅 ， 更易 引发 此病 ， 造成 新生 仔猪 大批 死亡 或 生 长发 育 不 良 ， 重 影 响 养 猪 严 业 的发展 ， 养猪户 造成 巨大 的 经济 损失 。２ １ 给 ０ ０年 ２月到 １ １月期 间 ， 我们 对 信 阳地 区存 栏 母 猪 在 １ ０ ０
３ ℃水 浴锅 中消化 ３ ｎ 在 超 净工 作 台 内慢 慢 将 ７ ０ｍｉ ， 消化 液 倒 出 ， 向瓶 中加 入 ＤＭＥ 工 作 液 进 行 中 再 Ｍ 和 ， 去培 养基 ， 烈振 摇 ， 消化 后 的睾 丸 细胞 充 倒 强 使 分从 组织块 上分 离 出来 ， 用培 养基 冲洗 玻璃珠 ， 再 洗 液 即成为 细胞 悬 液 ， 入 细 胞 瓶 中 ， 人 ３ 倒 放 ７Ｃ二 氧 化碳 培养箱 培 养 。
胞袋 解冻 离 心 后 轻 轻 移 入 超 净 工 作 台 内倒 出 上 清
ＤＭＥ 高糖 培养基 原液 ， 自北京 清大 天一 科 技有 Ｍ 购
限公 司 ， 液按 使用 说 明 书 配 制 ， 加 入 １ 血 清 原 另 ０ 即成 为 ＤＭＥ 高 糖 工 作 液 。细 胞 冻 存 液 由 ４ Ｍ ５／ ９ ６
１ ５ 分离 培养 病料 分别 接种 普通 营养 琼脂 平板 、 ． 鲜血琼 脂 平 板 、 康 凯 平 板 ， ３ ℃ 培 养 ２ ； 麦 置 ７ ４ ｈ 涂 片 ， 兰染 色镜 检 ， 取 培养 基 上 的典 型 单个 菌落 ， 革 挑 依次 接种 于麦康 凯琼 脂平 板 、 肉汤 ， 进行 纯培养 。 １ ６ 生化 试验 取 纯培 养菌 落接种 生 化反应 管 ， ． 于
头 以下 的 中小型养 猪场 开展 了猪 大肠杆 菌病 血清 型 流 行病学 调查 工作 。
１ 材 料 与 方 法
ｍｉ ； 其上 清液 ， ０ ／ ｎ离 心 １ ｎ 取 其 沉 ｎ取 ８０ ０ｒｍｉ ０ｍｉ； 淀 物配 成 菌 悬 液 ， 经 １ １℃ 处 理 ２ｈ 破 坏 Ｋ 抗 再 ２ ， 原， 即为 Ｏ抗 原 ； ℃保 存 ， 用 。按 照 大 肠 杆 菌 标 ４ 备
１０ ０ｍＬ， ３ 。下 转瓶 培养 。对 照组 按 传 统方 法 ０ 于 ７Ｃ 进 行解 冻培养 。
１ ５ 细胞存 活率 检 测 细胞 悬 液 和 台 盼 蓝染 液 按 ． １： （ ： 的 比例 混 合 ， 色 ２ ３ｍｉ １ Ｖ Ｖ） 染 ～ ｎ后在 倒 置
显微 镜下 用血球 计 数 板进 行 细 胞 计数 ， 区分 出活 并
１ 材 料 与 方 法
好 的去 皮睾 丸 称 重 ， 后 将 睾 丸 组 织 剪 成 厚 约 ０ ２ 然 ． ｃ 的碎 片 ， 入一个 装有 玻璃 珠并 经高 温灭 菌处 理 ｍ 转
的抽滤 瓶 中 ， 继续 向抽 滤瓶 中加 入 细 胞 消化 液 直 至
浸 没全 部 玻 璃 珠 及 其 上 放 置 的 睾 丸 组 织 ， 置 于 放
１１ 试 验 试 剂 ．
Ｈａ ｋ Ｓ液 ： 标 准 配 方 自配 。 ｎ 按
１ ４ 冻存 与解 冻操作 当睾 丸细胞 分离 后 ， 照 每 ． 按 ３ ５ｇ睾 丸组织 加 入 ２ ０ｍＬ冻存 液 的标 准制 成 细 ． ０
胞悬 液 ， 装入 冻存袋 中 ， 分 每袋 ２ ０ｍＬ， ０ 将其 分别 放 入一 适 当大小 的泡 沫 箱 内和 铁盒 内 ， 放 入 ～８ ℃ 并 Ｏ 的冰 箱 中让其 自然 冻结 。另取 少量 细胞 悬液放 人 若 干个 冻存 管 ， 照 常规冻 存方法 作检 测备 用样 品 。 按 分别 在细 胞冻 存 后 的 第 ３ 、 ２ 、 ６ Ｏ １ Ｏ ３ ０天 取 部 分 细胞 进行 解冻 。将 泡沫 箱 内的细胞 袋 和铁盒 中的细
２０ 。 ２ 份
准 抗 Ｏ血 清 凝 集 试 验 使 用说 明 书操 作 。鉴 定 发 病
场 猪大 肠杆 菌致病 菌株 血清 型 。
１ ８ 致 病性 试验 将 鉴 定 的大 肠 埃 希 氏 菌分 别 接 ． 种 于 营养 肉 汤 培 养 基 ，７Ｃ振 荡 培 养 ， ０ ／ ｎ ３。 ４０ ０ｒ ｍｉ 离 心 ２ ｎ 用等 量灭 菌 生理 盐 水 配制 悬 浮 液作 攻 Ｏｍｉ ， 毒 用 。将 ２ ７只 小 鼠 ， 为 ９组 ， 组 ３只 。８个 组 分 每 为试验 组 ， 个 组作 为对 照 ， 验 组 腹腔 注 射悬 浮 液 １ 试
收 稿 日期 ：０ ０１—２ ２ １ ～２２ 基 金 项 目： 汉 市 财 政 局 创 新 岗位 项 目（ ｃ２ ０ ０ ０ ３ 武 ｙｘ ０ ９ １ １ ） 作 者 简介 ： 向敏 （９ １） 女 ， 医 师 ， 士 ， １８～， 兽 硕 主要 从 事 细 胞 培 养 和 病 毒检 测研 究 ， — ｉ ｍｌ ６ ９ １ ６ ｃｒ Ｅ ｍａｌ ：ｘ １ ０ ＠ ２ ．ｏ ｎ
３ ℃培养 ， ７ 按说 明 书进行 生化 反应试 验 。
１ ７ 血 清型 鉴定 将经 生 理 生 化 试 验鉴 定 为 大 肠 ． 杆 菌的纯 培养 菌 株 于普 通 琼 脂 培 养 ， ２ｍＬ ． 用 ０５
石 碳酸 生理 盐 水 洗 下 以后 ， ２ ０ ０ ｒ ｍｉ 以 ０ ／ ｎ离 心 ５
１１ 病 料 采 自 ２ １ ． ０ ０年 以来 河南 省信 阳地 区平 桥 区 、 河 区 、 山县 、 山 县 、 狮 ’ 罗 光 固始 县 、 川 县 、 县 潢 新
１ ６ 发 生猪 大肠杆 菌病 的 中小 型 养 猪场 ； 中 ， ５个 其 肛 门拭子 １ ０份 ， 猪空 肠和小 肠 内容物 ｌ Ｏ份 ， 计 ２ 病 Ｏ 共
液， Ｄ 用 ＭＥ 工 作 液 重 悬 细 胞 ， 样 计 数 ， 重 悬 Ｍ 取 将
细胞 液 导 入 １ ０ ０ ０ ０ ｍＬ 的 转 瓶 中 ， 加 培 养 基 至 补
手手 指 尖离切 口约 ｌｍ 处 结 扎 ， ｃ 用浸 满 碘 酊 的棉 花 条沿 切 口向后 将整 个 阴囊包 裹 ， 入采 样袋 中 ， 人 装 放 装有 冰 袋 的泡 沫箱 内存 放备 用 。 １ ３ 原 代细 胞 制作 ．
皮， 继续 用 含 双 抗 的 Ｈａ ｋ Ｓ液 洗 涤 １ ２次 ， 洗 ｎ ～ 将
于生 产猪瘟 疫 苗 的牛睾 丸细胞 最好 是经 检测 无污 染 并能 产 出高效 价 病 毒 的合 格 细 胞 。但 是 ， 睾 丸 细 牛 胞传 代次 数是 有 限 的 。统 计 数据 表５代 次＿ 。很 明 显 ， ］ ］ 以现 有 的冻 存 管冻存 技 术 冻存 牛 睾 丸 细胞 等 待 检 测 结果 ， 再将 其解 冻用 于 大容 量 转 瓶 培 养 是不 可 能 的 ， 只有 采 取大 容量批 量 冻存技 术建 立可 靠 的健 康 牛睾 丸原 代 细胞贮 备库 才 可 以做 到这 一点 ， 目前 ， 内外 尚无 国 类 似 的成熟技 术 。本试 验 从 传 统 制作 方法 的改 进 ， 胰 酶 的消化 以及 大容量 批量 冻存 等方 面改 进牛 睾丸 细 胞 的原代 培养 技术 ， 研 究猪 瘟 细 胞 型 弱毒 疫 苗 为 的规 范化生 产 ， 提供技 术参 考 。
界送 入生鲜 睾 丸组 织 ， 加 了药 品生 产 质 量 管 理 规 增 范（ ＧＭＰ 车间 的污染 频率 ， ） 因此 ， 入 ＧＭＰ车 间用 进
胰蛋 白酶 三种不 同消 化方 法分 离牛 睾丸 细胞 。 １ ３ ２ 操 作方 法 从样 品袋 中取 出阴囊 ， ．． 在超 净工 作 台 内无 菌操 作 ， 眼科 镊 子 夹住 露 于 阴囊 切 口外 用 的附睾或 睾 丸 系 膜 组 织 ， 睾 丸 放 入 盛 有 Ｈａ ｋ Ｓ 将 ｎ 液 的平皿 中 ， 含有 双 抗 的 Ｈａ ｋ Ｓ 反复 洗涤 ， 用 ｎ 液 再 将 睾丸放 入另 一 干燥 平 皿 内， 眼科 剪 剪 去 睾 丸 表 用
ＤＭＥ 原液 、 ５ 新 生 牛 血 清 、 Ｏ Ｄ Ｍ ４ １ ＭＳ 混合 均 Ｏ 匀制 得 。分 别 装 入 ２ ０ ｍＬ血 清 袋 中 ， Ｋ ０ ８ ＧＹ 剂 量
下辐 照 ５ｈ 一２ ℃冻存 备用 。 ， Ｏ １ ２ 牛 睾丸 的采集 刚 出生 的奶 公牛 ， ． 运入 洁净 手 术室 ， 照常规 操作 快速 将 阴囊皮 肤环切 ， 按 同时切 断 皮下 筋膜 、 睾 、 管 等 组 织 ， 一 根细 绳 在 术 者 两 附 血 用
刘 涛 ，王 瑞 ， 曲哲 会 ，连 慧 香 ，魏 爱枝
（ 阳 农 业 高 等 专 科 学 校 ， 南 信 阳 ４ ４０ ） 信 河 ６ ０ ０
中图 分 类 号 ：８ ２ ６ 。 ￥ ５ ． １。 ２
文 献 标 识 码 ： Ｂ
文 章 编 号 ：５ ９６ ０ （ ０２ ０ —０ ２０ ０ ２ —０ ５ ２ １ ） １０ ３ —２
细胞 和死 细胞 以计算 细胞 活力 。 １ ６ 细胞 贴壁 率检 测 及 细 胞形 态学 观 察 转 瓶培 ． 养 ８ｈ后 ， 在转 瓶 显 微 镜 下 观察 细 胞 形 态 并 取 少 量
通讯作者 ： 高其 双，Ｅ ｍａｌｇｏ ｉ ｕｎ ５ ８ ｉａｃ ｍ — ｉ：ａｑｓ ａ ｇ １ ＠ｓ ．ｏ ｈ ｎ
３ ０
中 国兽 医杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 第 ８卷 ） １ 第 期
牛 睾 丸原 代 细胞 的培 养 技 术 与大 容 量 批量 冻 存 试 验
向 敏 ，陈 志 华 ，高其 双 ，黄 海 军 ，陶 弼 菲 ，占才耀 ，王连 芳 ，李 杰
（ 北 省 武 汉 市 畜牧 兽 医科 学 研 究 所 ， 北 武 汉 ４ ０ ６ ） 湖 湖 ３０ ５ 中图 分 类 号 ： ９ Ｑ２ １ 文 献标 识 码 ： Ｂ 文 章编 号 ：５ ９６０ （０ ２ ｏ一０ ００ ０ ２—０ ５ ２ １ ） ｉ０ ３—２