两种检测方法测定降钙素原的精密度验证及比对研究

两种检测方法测定降钙素原的精密度验证及比对研究
蔺亚晖;程军;于金星;王恺隽;张思明;丛洪瀛;王飞燕
【摘要】目的比较两种不同检测方法测定降钙素原(PCT)结果的可重复性和室内精密度,为临床和实验室PCT检测方法的选择提供相关依据.方法本研究分别用电化学发光法(ECLIA) Elecsys BRAHMS PCT检测试剂与免疫层析法PCT检测试剂,依据美国临床实验室标准化协会(cLsI)的EP15-A2和EP9-A2文件规定,以ECLIA 法为比较方法,以免疫层析法为试验方法,进行比对评估.结果 ECLIA法在低、中浓度检测水平组的重复性及实验室内SD值均分别小于厂家说明书声称的SDR-声和SDL-声;高浓度组的重复性小于SDR-声,但实验室内SD值大于SDL-声和SDL-验;而免疫层析法各浓度水平检测结果无论是重复性还是实验室内SD值均大于厂商声明值和验证值.经回归分析,两种方法的检测结果可比性比较差.结论 ECLIA法和免疫层析法两种PCT检测试剂中,ECLIA法更符合EP15A2对精密度的要求而且二者的检测结果不具有可比性.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2016(023)007
【总页数】5页(P829-833)
【关键词】降钙素原;ECLIA;免疫层析法;比对分析;EP15-A2;EP9-A2
【作者】蔺亚晖;程军;于金星;王恺隽;张思明;丛洪瀛;王飞燕
【作者单位】国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病
中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037;国家心血管病中心中国医学科院阜外医院临床检验中心,北京100037
【正文语种】中文
感染是造成人类死亡最重要的因素之一，据WHO统计，2012年全球因感染而死亡的人数约为950万人，占总死亡人数的17%［1］。

感染的临床症状和体征缺乏特异性，可靠的辅助诊断方法对感染的诊断和治疗具有重大意义。

理想的诊断方法应能早期发现感染，鉴别感染类型，验证感染程度和预后，并能指导抗生素的使用，而降钙素原（procalcitonin，PCT）由于具有以上特征，已受到临床的普遍认可［2］。

PCT是严重细菌感染和脓毒症的诊断标志物。

健康人体内PCT的水平极低，但在感染后3～6小时内，PCT会迅速升高，并在感染进程中持续呈高水平。

PCT的半衰期约为24小时，稳定性较好［3］。

根据PCT水平判断脓毒症的病情进展，区别感染病原类别具有可靠的参考意义，对于脓毒症患者早期针对性用药，抗生素疗程指导及预后评估都有积极的临床价值［4］。

目前，国内外常用的针对血清PCT的定量检测方法主要有电化学发光法（electro chemiluminescence immunoassay，ECLIA），化学发光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和免疫层析法等。

近年来，随着与国外交流的日益加深，我国实验室临床检测的研发能力得到了显著的提高，如PCT等具有重要临床意义的检测项目已越来越多地实现国产化，PCT检测的即时检验（Pointof-Care Testing，POCT）已投入临床使用。

但由于目前存在POCT 使用者的质量管理体系不完善、产品质量和技术要求不统一、不同企业生产的快速检测仪器与配套的试剂耗材质量、技术要求也不统一等问题，实际应用中可能会出
现数据重复性差，实验室内检测变异大等现象。

临床实验室对分析系统精密度和正确度的验证一直没有具体标准，一般多采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP5［5］的方法评价精密度，采用CLSIEP9［6］进行方法学比对评价偏倚。

但是，这两种方法的步骤较为繁琐，实验周期长，对于需要进行较多项目验证的实验室需投入大量人力、物力、财力，可操作性不强。

本研究的目的是在选择不同检测方法测定PCT时先用相对简单的EP15对精密度进行验证，然后根据 EP9对ECLIA法及免疫层析法检测结果进行比较，从而为实验室管理及临床决策提供可靠的依据。

1 仪器与试剂
比较组分析仪（X）使用的是Cobas®e601全自动免疫分析系统、配套 Elecsys BRAHMS PCT检测试剂盒（ECLIA法），以及相关定标和质控品（批号：17935002）。

试剂厂商为罗氏诊断产品（上海）有限公司，试剂检测范围为
0.02～100ng/mL，储存条件：2～8℃。

实验组分析仪（Y）使用的是由武汉明德生物科技股份有限公司生产的POCT免疫定量分析仪（型号QMT8000）、PCT检测试剂盒（免疫层析法）及配套质控品（批号：1412022）。

试剂检测范围：0.1～200ng/mL；储存条件：4～25℃干燥环境储存。

2 标本来源
每日正常收集患者血清8份，连续收集5天，共40份。

样本浓度控制在分析方法的线性范围内，并涵盖正常参考区间及异常高值，同时分别按照两种仪器厂商说明书中提供的高、中、低浓度的样本标准收集患者血清（免疫层析法试剂说明书中仅声明了高、低两种浓度）。

血清保存条件：-20℃冷冻，1次冻融。

3 方法
3.1 精密度试验检测两种方法的可重复性［Repeatability（Within-Run
Precision）］、天间精密度和室内精密度（Within-Laboratory Precision）。

精密度测定方法：选择ECLIA法厂家声明的低、中、高三个浓度水平和接近于两个
医学决定点的患者血清，以及免疫层析法厂家声明的低、高两个浓度水平的患者血清，每一水平上同一样本每天批内重复测定3次，连续5天。

根据每一批次每一
样本差异计算重复精密度，从所有结果中计算室内精密度。

计算可重复性和实验室内SD：按CLSI EP15-A2［5］公式分别计算可重复性和实验室内标准差（SD），以判断是否符合（不大于）说明书标注的重复性变异系数（coefficient of variation CV）及SD水平。

S r为重复性标准差；Sl为实验室内标准差；Xdi为每天每次测定结果值；Xd为每天测定结果的均值；d为所有结果
的均值。

D为实验天数，共5天；n为每天重复测定次数，共3次。

如果以上精
密度验证数据符合厂家数据，验证通过；否则需计算验证值SDR-验和（或）SDL-验。

3.2 比对试验因分析仪（X）为可溯源的封闭检测系统，参加室间质评的成绩优秀，定期校准，检测结果可靠，故用作比较方法。

分析仪（Y）为试验方法。

参考CLSIEP9-A2文件，设计实验室比对试验，对两种不同方法的PCT检测试剂进行
相关性分析。

数据的收集：样本的双份测定中，指定第一次测定顺序，顺序中的浓度应尽可能随机排列；第二次检测按反向顺序进行，这样可以减少交叉污染及漂移对重复测定标本平均值的影响。

分析方法和比较方法均应按上述步骤进行，但每种方法可以有不同的开始顺序。

3.3 离群值检测按照EP15 A2，EP9A2中的方法内双份测定的离群值检查的方法
进行数据删除
3.4 X合适范围检验及回归分析一般认为，当相关系数r≥0.975或r2≥0.95时，X 的取值范围合适。

绘制测定结果的散点图，并求出r和斜率和截距。

3.5 计算系统误差及相对偏差当r≥0.975或r2≥0.95，认为线性回归分析的斜率
以及截距均可靠，将医学决定水平（X c）代入线性回归方程，求得Yc，并计算两系统间的系统误差（SE）和相对偏差（SE r），SE=|Y c-X c|，SE r=S E/X c×100% 3.6 可接受性能的判断判断临床可接受性能：因CLIA′88 （Clinical Laboratory Improvement Amendments）《美国临床实验室改进修正法案》［7］未规定PCT的允许误差范围，故根据临床实践经验，将SEr≤10%暂定为判断标准。

如某一医学决定水平的SEr未超出此标准，则判断相对偏差可为临床接受。

1 两种检测方法的精密度评价
ECLIA法精密度验证见表1。

由表1可以看出，ECLIA法在低浓度（0.08ng/ mL）和中浓度（0.44ng/mL）检测水平的可重复性及实验室内SD值均分别低于厂家声称的SDR-声和SDL-声，
根据EP15-A2认为精密度验证通过。

高浓度组（48.0ng/mL）的可重复性小于厂家声称的SDR-声，但实验室内SD值大于厂家声称的SDL-声及SDL-验。

这种情况下，根据EP15-A2认为该高浓度的精密度验证未通过。

在医学决定浓度为0.5ng/mL水平时，可重复性CV值为1.5%，SD值为
0.0068ng/mL；室内精密度CV值3.4%，SD值 0.01544ng/mL。

当医学决定浓
度在2.0ng/mL时可重复性CV值为1.6%，SD值为0.031ng/mL；室内精密度CV值 3.6%，SD值0.070ng/mL。

由于在厂家在说明书中未声明医学决定浓度相应的SD值，且目前我国尚没有PCT检测相关的实验室室内质量评价要求，可根
据ISO 15189：2012《临床检验定量检测方法确认和性能验证》［8］及CNAS-CL中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service）38：2012《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明》［9］的要求，可以以厂商提供的研发标准界限作为允许总误差（TEa）来设定相应的声明值来进行评估。

如果以可重复性精密度（CV）＜1/4 TEa，室内精密度（CV）＜
1/3 TEa的标准确定厂商声明值，那么根据EP15-A2也可认为该医学决定浓度都是通过的。

同时根据以上标准，计算出高浓度组的 SD值的申明值，按照EP15-A2也认为是通过的。

免疫层析法精密度验证见表2。

由表2可以看出，POCT检测免疫层析法在低浓度组中，可重复性和室内精密度的CV值分别为60%和60.4%，SD值为分别为0.354ng/mL和0.356ng/mL；高浓度组的可重复性及室内精密度的CV值分别为30.1%和31%，SD值分别为9ng/mL和9.3ng/mL，均远大于厂商声明值及验证值。

各组浓度均未通过EP15-A2要求的精密度验证。

因为PCT目前没有行业标准，参考目前的《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》［10］，以实验室内精密度的CV值小于10%的标准来作为临床可接受范围，则无论可重复性及室内精密度的CV值均大于10%，为实验室不可接受。

2 离群值检验
PCT分别于两种检测方法重复测定结果均无离群值出现，相同PCT浓度于两种检测方法间也无离群值出现。

3 两种检测系统测定结果的相关性与回归分析
比较组分析仪X（ECLIA法）和实验组分析仪Y（免疫层析法）回归统计的斜率和截距，见图1和表3。

X的浓度范围（0.14～10.7ng/mL）；Y的浓度范围（0.12～4.08ng/mL）表4显示两种检测系统的医学决定浓度有很大不同。

由于r＜0.975，故无法使用线性回归方程计算系统间的系统误差和相对偏差。

精密度和正确度验证通常在方法首次引入实验室内时，或者是室间质量评价/能力验证结果未通过、实验室采取纠正措施后进行。

通常的做法是实验室先列出方法预期的精密度和正确度性能指标，比如可以参考我国行业标准，作为实验室的要求；其次，实验室在选择新方法时，应确保其声称的性能指标满足预期实验室的要求；
第三步，通过实验验证方法在实验室能否达到其声称的性能指标；第四步，如果方法不能达到其声称的指标，通过计算来确定实验得到的性能是否满足实验室的要求［11］。

参照EP15-A2文件，本研究按以上4个步骤对ECLIA法及免疫层析法检测PCT 进行精密度验证。

结果表明，ECLIA法在低、中浓度检测水平的重复性及实验室内SD值均分别低于厂家声称的SDR-声和SDL-声，根据EP15-A2认为精密度验证通过。

高浓度组重复性同样小于SDR-声，虽然实验室内精密度大于SDL-声及SDL-验，但如果以厂商提供的研发标准界限作为允许总误差（TEa）作为厂商声明值进行评估的话，根据EP15-A2也可认为该浓度都是通过的。

同样根据厂商的产品标准及第三方检测报告，重复性CV值及实验室内CV值均小于10%，可认为满足实验室及临床需求。

同时在两个医学决定浓度水平进行验证时，两个浓度水平的重复性CV值和SD值，以及室内精密度的CV和SD值也均满足 CNAS-CL38的要求。

根据EP15-A2也同样认为该医学决定浓度精密度都是通过的。

而在对POCT免疫层析法进行可重复性的验证中，高低两个浓度组的CV值分别为60%和30.1%，在验证精密度时高低两个浓度组的CV值分别为60.4%和31%，均大于厂商声明值及验证值，未通过EP15-A2的要求。

检测设备方法为免疫层析法，免疫层析胶体金技术无法直接实现定量和半定量检测，用通过反应着色的比较来用于间接定量时有其不足［12］。

此外，也有文献报道POCT检测精密度的CV值偏大，如黄静沁等同样比对了电化学发光法和POCT法检测心肌标志物，结果显示POCT检测CV值高达46%［13］。

如果以可重复性及室内精密度的CV值小于10%来作为实验室及临床可接受范围，也同样不能满足实验室的需求。

由于免疫层析法试剂厂商未在其说明书内声明相应的医学决定浓度，也没有研发标准声明的CV值及SD值，故本研究未检测该浓度的可重复性及室内精密度。

参照EP9-A2文件，本研究对ECLIA法和免疫层析法这两种检测系统PCT测定结
果的可比性和相对偏差进行评估。

从结果看，比对两种检测方法测定结果的相关系数r值小于0.975，因此无法建立有效的回归曲线。

这一结果可能是由于目前国内许多PCT检测试剂所宣称的可溯源性并非根据BRAHMS标准PCT参考物质溯源，因此造成检测结果上的差异。

BRAHMSPCT的校准是 ISO 17511导则在体外诊断产品实现溯源性的具体体现，既有自己的一级校准品（参考物质），又具有自己的溯源校准传递做法，能够确保患者样品检测结果在使用该公司产品系列中得到一致性［14］。

以往的研究结果表明，尽管POCT的优势包括快速获取结果、大大缩短样本周转
时间，仪器小型便携，操作简单、非专业人员经简单培训或阅读说明书即可操作，综合使用成本低等，但是目前该系统的使用仍存在行政管理不明确、政策法规不明确、使用者的质量管理体系不完善、产品质量和技术要求不统一、不同企业生产的快速检测仪器与配套的试剂耗材质量和技术要求也不统一等问题，因此检测结果容易出现室内精密度偏大，在医学决定浓度的精密度不为临床诊疗所接受［15］。

由于本研究中免疫层析法的PCT检测结果在各浓度均未通过EP15-A2的认证，且两种方法的结果不具有可比性，因此我们建议在实验室中采用ECLIA法进行PCT
检测。

如需使用POCT免疫层析检测方法，则应在投入实验室检测之前先按照
EP15-A2进行精密度验证试验，确定其通过精密度验证后再根据EP9进行后续系统性的方法比对实验，并进行相关调整。

【相关文献】
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2012.Geneva：World Health Organization（http：//www.who.int/healthinfo/global_ burden_disease/estimates/en/，accessed 21 September 2015）.
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sepsis.Clinical laboratory new，2009，7：10-12.
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［6］Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples；Approved Guideline-Second Edition，EP9-A2.
［7］Clinical Laboratory Improvement Amendments（CLIA）′88美国国会颁布临床实验室修正案（CLIA′88修正案）.
［8］ISO 15189：2012《临床检验定量检测方法确认和性能验证》.
［9］CNAS-CL38：2012《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明》. ［10］中华人民共和国卫生部卫生行业标准WS/T 403-2012：《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》.
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［14］冯仁丰.临床检验质量管理技术基础.第2版.上海：上海科学技术文献出版社，2007. ［15］现场即时检验（POCT）临床应用标准专家共识（草案）.临床检验杂志，2012，1（4）：255-258.。