肝糖原的提取与鉴定实验报告

肝糖原的提取与鉴定实验报告
实验六肝糖原的提取
实验六肝糖原的提取、鉴定与定量
(生物化学实验操作考核卷)
姓名，学号，专业，级班组，月日
目的要求:
1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4. 熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况，采用合适的混匀方法)。

5. 正确掌握溶液转移的操作。

6. 正确操作使用分光光度计。

实验原理:
(一)肝糖原的提取、鉴定
糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶
且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。

糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95,乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。

这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。

糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO4十2NaOH ? Na2 SO4+Cu(OH)2?
2Cu(OH)2十C6H12O6 ? 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O
2CuOH ? Cu2O?(红色)+H2O
Cu(OH)
CuO?(黑色)+H2O
(二)肝糖原的定量
糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。

该物质在620nm处有最大吸收。

糖含量在(10?100)?g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。

实验材料:
(一)仪器
1. 普通离心机，室温?100?恒温水浴箱(×2)，722型分光光度计，精度为
10mg级电
子天平(×1)
2. 剪刀(×1)，镊子(×1)，研钵(×1)
3. 试管架(×1)，10mL离心管(×2)，(100×15)mm试管(×6)
4. 刻度吸量管(2mL×1，5 mL×2)，1000μL微量可调取液器(×1)
5. 100mL容量瓶(×1)
6. 白瓷反应板(×1)
(二)实验样品和试剂
1. 鸡肝。

2. 95,乙醇。

3. 0.31mol/L(5,)三氯醋酸溶液:称
取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2，163.39)5g，加蒸馏水溶解至100 mL。

4. 0.15mol/L NaCl溶液:称取8.8g NaCl加蒸馏水溶解至1000 mL。

5. 12mol/L HCl:浓HCl原液(36%?38%)。

6. 12.5mol/L(50,)NaOH:称取NaOH 50g，用蒸馏水溶解至100mL。

7. 碘试剂:碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。

8. 班氏试剂:称取柠檬酸钠
(C5H5Na3O7?5H2O，294.10)173g和无水碳酸钠(Na2C03，105.99)100g溶于蒸馏水800mL中，加热促溶。

冷却，慢慢倾人17.3,硫酸铜(CuSO4?5H2O，249.68) l00mL，边加边摇。

再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。

此试剂可长期保存。

9. 5.35mol/L(30,)KOH溶液:称取KOH 30g，加蒸馏水溶解至100 mL。

11. 标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500 mL。

12. 17mol/L(90,)H2SO4:量取蒸馏水30mL，加浓H2SO4500 mL。

13. 蒽酮显色剂:称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。

此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4?5天。

实验方法:
吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。

(一)肝糖原的提取与鉴定操作流程如下。

鸡肝约1 g，剪碎
，5%CCl3COOH 1 ml
，
5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆
3分钟(4000 r / min)
，5 ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟
4000 r / min)
上清(弃去)
沉淀
，蒸镏水2 ml
鉴定方法?
1ml
，浓HCl 0.2mL
0.1mL(2滴)
，班氏试剂0.2mL(4滴)
混匀
沸水浴2
注意事项
1. 肝糖原提取一步，向上清液中加入5mL95,乙醇后，务必注意混匀。

由于上清液为水溶液，比重大于95,乙醇，溶液分成两层。

加之上清液已3mL多，总量接近9mL，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2. 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。

葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20?30个之间使碘呈现紫色，60个以上的
会使碘呈现蓝色。

淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下(通常8?12个葡萄糖残基)，吸附碘后呈现红棕色。

3. 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

(二)肝糖原定量测定操作流程如下
鸡肝0.070.15 g ，30%KOH 1.5ml 沸水浴15分钟
取干净试管4支，按下表操作。

试剂(ml)
蒸馏水
标准葡萄糖溶液(0.05mg/mL)
糖原消化液
0.2%蒽酮溶液
定其余各管溶液的吸光度(A)。

计算:
肝糖原(g/100 g肝组织) = 考核操作内容:
1(吸量管操作(5分);
2(可调式微量取液器操作(5分); 3(溶液混匀操作(视具体情况，采
用合适的混匀方法)(5分);
4(溶液转移操作(5分); 5(分光光度计比色操作(5分)。

操作标准:
下面每1项操作满分记5分，操作
共计25分。

(一)吸量管操作
1(执管:要求右手拿吸量管，左手
拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按
压吸量管上口来调节吸取液量的刻度;吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。

2(坐姿:要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。

3(吸取溶液:吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内;调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。

4(排出液体:吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。

不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。

(二)可调式微量取液器操作
1(设定容量值:转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。

顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。

在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。

2(吸液:
(1) 选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间A样品 A标准×0.05 100
肝组织重(g) × 100 1000 ×1.11 空白管 1.0 —— 2.5 标准管— 1.0 —2.5 样品管—— 1.0 2.5 混匀，沸水浴10分钟，冷却。

在分光光度计620 nm 波长处，用空白管溶液调零，测
隙;
(2) 把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。

3(放液:
(1) 将吸头口贴到容器内壁底部并保持100?~40?倾斜;
(2) 平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体;
(3) 压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。

按吸头弹射器除去吸头。

4(压放按钮时保持平稳;加样器不得倒转;吸头中有液体时不可将加样器平放。

取液器吸嘴为一次性使用。

实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。

(三)溶液的混匀(操作流程中下划实线的3处)
1(肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5mL95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2(肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 mL容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。

3(肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。

因蒽酮溶液(浓硫酸配制)比重大于样品水溶液很多，一加入
便沉于管底(加试剂的顺序一定不能颠倒)，不倾斜试管旋转混匀不了。

(四)溶液的转移(操作流程中下划波纹线的两处)
1(在研钵中研磨后的肝匀浆转入试管离心可用滴管或取液器吸取转移，如果采用倒入，不能洒落管外，应尽量转移干净。

2(肝组织沸水浴后的消化液转入100 mL容量瓶前应冷却;转入时用玻璃棒引入，玻璃棒头插入容量瓶靠瓶颈磨口下约1cm处，玻璃棒上端不要靠上瓶口边沿，引入时试管口靠玻璃棒的位置靠近容量瓶口，不要离开瓶口太高，以免消化液沾染玻璃棒较长;转入过程中，溶液不要沾染到容量瓶磨砂口上，更不能滴洒到容量瓶外面;应用蒸馏水洗消化管3遍以上，洗液一并全部转入容量瓶。

(五)分光光度计操作
1(波长选择，仪器调零，空白调零，灵敏度挡选择等操作正确。

2(手拿比色杯毛面。

3(比色溶液不能洒落比色杯外或试管外。

4(比色过程操作正确。

实验结束后，器材按要求清洗干净、器材与试剂瓶归回原位和台面卫生满分5分
实验报告结果要求
1(肝糖原的提取、鉴定
鉴定方法?和鉴定方法?中最后的“呈色对比”和“观察颜色变化”，结果一定要明确表达是“有变化”或“没有变化”，有变化的话还要具体写出变成什么颜色了。

而且要作出
篇二:肝糖原的提取和鉴定
肝糖原的提取和鉴定
一、实验目的
1、学会和掌握肝糖原提取和鉴定的原理和方法。

2、正确掌握使用离心机的方法步骤。

二、实验原理
三、实验步骤
(一)、肝糖原提取
1、用脱臼法处死白鼠，立即取出肝脏，迅速以滤纸吸取附着的血液。

称取肝组织约2g，置研钵中，加入10%三氯乙酸2ml，用剪刀把肝组织剪碎，再加石英砂少许，研磨5min。

2、再加5%三氯乙酸4ml，继续研磨1min，至肝脏组织已充分磨成糜状为止，转入离心管，然后以2000r/min离心10min。

3、小心将离心管上清液转入另一个离心管中，加入同体积的95%乙醇，混匀后，此时糖原成絮状沉淀析出。

4、溶液以2000r/min离心10min。

弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上
1~2min。

5、在沉淀内加入蒸馏水2ml，用细
玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即成糖原溶液。

(二)、鉴定
1、取2支小试管A、B，一支A加糖原溶液10滴，另一支B加蒸馏水10滴，然后在两管中各加碘-碘化钾溶液1滴，混匀，比较两管溶液颜色有何不同。

2、再取2支小试管，将剩余的糖原溶液平分倒入两试管，试管甲加浓盐酸3滴，试管乙加蒸馏水3滴，将两管在沸水浴中加热10min以上。

取出冷却，试管甲中逐滴加入20%NaOH溶液，并且PH试纸检验，直至溶液成中性。

试管乙中加入同等滴数的蒸馏水。

3、向甲、乙两试管各加入班氏试剂2ml，再置沸水浴中加热5min，取出冷却。

观察有无沉淀生成。

注意事项:
1、实验小白鼠在实验前必须饱食。

2、脱臼法处死小白鼠:手提着小白鼠将其小白鼠尾巴将其从笼子里取出，使其四脚着地，
另一支手按着小白鼠耳后，尾巴向外拉，使其脊柱断节，背部脊髓断裂，致使四肢瘫痪。

3、肝脏离体后，所得肝脏必须迅
速以三氯乙酸处理。

4、研磨应充分，这是实验成败的关键。

5、离心时与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机。

6、鉴定的第(2)步，试管甲中溶液必须调至中性或偏碱性。

四、实验结果
试管A
棕红色
试管B 黄色
试管乙
无沉淀试管甲砖红色沉淀
分析:
1、实验小白鼠在实验前必须饱食，因为空腹时，血糖含量降低，肝糖原分解来提高血
糖含量，肝糖原含量易于减少或耗尽。

2、吸去肝脏附着的血液，可能是血液中含有还原性的葡萄糖，会影响后面糖原的鉴定。

3、肝脏离体后，肝糖原会在酶的作用下迅速分解。

所以肝脏必须迅速以三氯乙酸使蛋
白质变性以防其分解。

4、研磨应充分，研磨使细胞破裂，肝糖原释放出来。

研磨不充分会得不到糖原或含量
很少，影响后面的鉴定。

加石英砂利于研磨。

5、经第一次离心，蛋白质会沉于离心管底部糖原则留于溶液中。

(上清液中)。

6、糖原不溶于乙醇溶液，所以加入同体积的95%乙醇，混匀后，糖原会成絮状沉淀析
出。

浑浊程度反映了糖原的多少。

越浑浊，糖原越多。

7、经第二次离心，糖原沉于离心管底部，糖原微溶于水，所以在加入蒸馏水后，沉淀
会在搅拌下溶解成糖原溶液。

8、糖原为高分子化合物，与碘作用呈棕红色，所以试管A出现棕红色溶液。

试管B
中为水，加入碘-碘化钾后，将仍为碘-碘化钾溶液的颜色，黄色。

9、糖原无还原性，不会与班氏试剂在沸水浴中生成砖红色的Cu2O沉淀，
所以试管乙
中仍为班氏试剂的颜色，蓝色，无沉淀。

10、糖原会在浓盐酸在沸水浴下分解成小分子化合物，其中有还原性的麦芽糖和葡
萄糖。

还原性糖会在碱性条件下，班氏试剂与其在沸水浴下生成砖红色Co2O
沉淀。

班氏试剂为碱性溶液，所以须用20%NaOH溶液中和至中性。

所以试管甲中会出现砖红色沉淀。

11、班氏试剂中有CuSO4，NaCO3和柠檬酸钠。

CO32-提供碱性环境，柠檬酸钠
为络合物，帮助Cu2+与葡萄糖反应，沸水浴下，Cu2+变为Cu+，即Cu2O，Cu2O 为砖红色沉淀。

葡萄糖被氧化为糖酸，麦芽糖亦如此。

所以试管甲中有砖红色沉淀。

12、结果表明，肝糖原被成功提取出来，且含量较多。

篇三:肝糖原提取和测定
肝糖原的提取和鉴定
一、实验目的
1.了解肝糖原的性质并掌握其提取
的方法。

2.熟悉肝糖原的鉴定方法。

二、实验原理
肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一。

其储存量虽然不多，但在代谢过程中，它是动物体内糖的重要的来源之一。

肝糖原的合成或分解对血糖浓度的调节起着重要的作用。

糖原属于高分子糖类化合物，微溶于水，无还原性，与碘作用变成红棕色。

提取肝糖原是利用三氯醋酸破坏肝组织中的酶，且肝组织中的蛋白质也被三氯醋酸所沉淀，而糖原仍留在溶液中。

过滤除去沉淀，滤液中的肝糖原可借加入的乙醇而沉淀。

将沉淀的糖原溶于水，即可得到糖原溶液。

糖原与碘作用呈红棕色。

糖原被酸水解为葡萄糖，可用班氏试剂检验。

利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定组织中糖原的存在。

三、实验材料、仪器和试剂
1. 材料:
小白鼠等动物新鲜肝脏组织
2. 仪器:
(1)天平 (2)研钵 (3)离心
机
(4)离心管 (5)恒温水浴锅 (6)试管
(7)广泛试纸(8)移液管(9)洗耳球
(10)电炉(11)量筒 (12)滤纸
3( 试剂:
(1)10%的三氯醋酸溶液
(2)5%的三氯醋酸溶液
(3)95%乙醇溶液
(4)浓盐酸
(5)20%的NaOH溶液
(6)碘液:(取碘1g、碘化钾2g溶于500mL蒸馏水中)
(7)班氏试剂:(将硫酸铜17.3g溶于100mL温蒸馏水中;取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g溶于700mL温蒸馏水中，待冷却后，将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠和碳酸钠混合液中，最后用蒸馏水稀释至1000mL)
四、操作步骤
(一)肝糖原的提取
(1)肝匀浆的制备:迅速处死小白鼠，立即取出肝脏，用滤纸吸取附着的血液。

称取约1g肝脏置研钵中，加入少
许石英砂及10%的三氯醋酸溶液1mL，研磨至呈乳状后再加入5%的三氯醋酸
2mL，继续研磨，直至肝脏组织已充分磨成均匀糜浆。

(2)提取糖原:将制备好的肝匀浆以3000r/min的转速离心10min。

取上清液于另一离心管并量取体积，加入等体积的95%乙醇溶液，混匀后静置10min，使糖原呈絮状析出。

将沉淀溶液以3000r/min的转速离心10min，弃去上清液，将离心管倒置于滤纸上1,2min，向沉
淀中加入蒸馏水1mL，用细玻璃棒搅拌至溶解，即成糖原溶液。

(二)肝糖原的鉴定
(1)与碘的呈色反应:取小试管2支，一支加入糖原溶液10滴，另一支加入蒸馏水10滴，然后两管各加入碘液2滴，混匀。

观察两试管中溶液的颜色变化，并解释现象。

(2)糖原水解液中葡萄糖的鉴定:在剩余的糖原溶液中加入浓盐酸3滴，放入沸水浴中加热10min，取出冷却，用20%的NaOH溶液中和至中性(用pH试纸检测)。

然后加入班氏试剂2mL，再置沸
水浴中加热5min，取出冷却。

观察管中沉淀的生成，并解释现象。

五、注意事项
(1)实验用小白鼠在实验前必须饱食，因为空腹时肝糖原易分解而使其含量减少。

(2)肝脏离体后，肝糖原会迅速分解，所以在杀死动物后，所得刚脏必须迅速用三氯醋酸溶液处理。