反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因
罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民
【摘要】目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分别为84.88%、87.10%和79.17%,符合率为97.33%、94.74%和88.37%.结论:膜反向斑点杂交技术是检测部分MTB耐INH、RFP和SM基因型快速、简便的方法.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(037)004
【总页数】4页(P759-762)
【关键词】结核分枝杆菌;药物耐受性;反向斑点杂交;聚合酶链式反应;基因
【作者】罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民
【作者单位】湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004
【正文语种】中文
【中图分类】R34
近年来，我国的结核病发病率和耐药率均有上升趋势，尤其是耐多药结核病和非结核分枝杆菌病及艾滋病并发的结核病的疫情十分严峻，并严重损害着人们的健康。

因此，如何快速、准确地检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)对主要一线药物的耐药性，成为广大学者所关注的课题。

目前临床上检测结核药敏大部分仍延用绝对浓度法和比例法等，其耗时6～8周，结果判定有一定主观性，难以标准化。

Wu等[1]利用反向斑点杂交技术检测利福平(rifampcin,RFP)的耐药基因，准确率达到92.8%，本文作者采用此技术同时检测了RFP、异烟肼(isoniazide,INH)和链霉素(streptomycin,SM) 3种抗结核药物的相关耐药基因，并探讨反向斑点杂交技术与绝对浓度法的相关性。

1 材料与方法
1.1 实验材料 97株试验菌株取自2008年2—12月本院门诊和住院患者临床分离菌株。

H37RV敏感株(ATCC 27294)购自北京结核病胸部肿瘤研究所参比室。

1.2 细菌基因组DNA制备刮取改良罗氏培养基上试验菌落悬浮于1×TE液。

用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司H6529)按说明书操作步骤提取DNA，-20℃保存备用。

1.3 膜芯片设计与引物合成根据ropB、katG、inhA和rpsL基因序列设计19种探针[2-3]。

所有探针通过miniblotter MN45标记于杂交膜上。

引物和探针的合成以及探针的标记由深圳亚能生物技术有限公司完成。

1.4 PCR扩增ropB、katG、inhA和rpsL基因设计可以分别用于ropB、katG、inhA和rpsL基因的引物[4-5]，其中下游引物5′端含有生物素标记。

4个基因的扩增分别在2个用反应管中完成。

第一管反应液25 μL，扩增ropB 、katG和inhA基因，第二管反应液25 μL扩增rpsL基因。

反应体系如下：模板DNA 20 ng、
2.5 mmol·L-1 dNTP 2 μL，25 mmol·L-1MgCl2 1.5 μL，25 μmol·L-1上
下游引物各0.5 μL，2.5 U DNA Taq酶，2.5 μL 10×PCR缓冲液。

使用ABI-7300仪器进行扩增，循环条件为：50℃、2 min；95℃、10 min；95℃、45 s；68℃、1 min，30个循环；95℃、30 s；54℃、30 s；68℃、1 min，30个循环；68℃、10 min。

扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测。

1.5 反向斑点杂交与结果判读取出膜条，用铅笔在其空白区编号，放入15 mL塑
料离心管中，加入5 mL杂交缓冲液(1×SSC，0.1% SDS)和相应的2管PCR产物，沸水浴10 min，放入预热的杂交箱中59℃杂交90 min。

将膜条转移至装有40 mL预热洗液(0.5×SSC、0.1%SDS)的离心管中，59℃轻摇洗涤15 min。

移出膜条，放入事先配好的1∶2 000的POD溶液中，室温轻摇洗膜30 min，弃去POD液。

用杂交缓冲液室温轻摇洗涤5 min，共洗2次,将洗好的膜条浸泡于
TMB显色液(19 mL 0.1mol·L-1柠檬酸钠、2 g·L-1 TMB 1 mL、3% H2O2 10
μL)，避光显色20 min，出现的蓝色斑点即含有相应的待检基因。

1.6 菌种鉴定与药敏临床分离培养后的分枝杆菌的菌种鉴定和药物敏感试验参照《结核病诊断细菌学检验规程》[6]进行。

绝对浓度法药敏结果判定标准参考2001年中华医学会结核病学分会颁布的肺结核诊断和治疗指南[7]。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。

2 结果
2.1 菌种鉴定及绝对浓度法药敏试验结果 97株临床分离株中，只对其中92株结
核分枝杆菌进行绝对浓度法药敏试验和相应的反向斑点试验。

其中5株对3种药
物全部敏感，20株对RFP和INH同时耐药，8株对INH和SM同时耐药，3株
对RFP和SM同时耐药，37株对INH、RFP和SM同时耐药。

共65株对RFP耐药，73株对INH耐药，53株对SM耐药。

2.2 4 种基因的PCR扩增结果 92株MTB临床分离株与H37RV均扩增成功，阴
性对照无扩增条带，阳性对照有5条带，分别为190、210、290和460 bp。

2.3 反向斑点杂交检测结果 H37RV 以及5株敏感菌株未检出以上4种突变基因。

92株临床菌株突变基因检测结果见表1，耐INH、SM和RFP基因检测结果见表2，部分膜芯片的杂交显色结果见图1(封三)。

表1 92株菌株的突变基因Tab.1 Mutant genes of the 92 strainsGENE Mutant strain Mutant [η/%(n/n)] Multi-mutation False positive mutation False negative mutationkatG:315M 58 95.08(58/61) 2 13inhA:-15M 2 3.28(2/61)
1(1.60%) rpsL:43M 29 76.32(29/38) 5 12rpsL:88M 7 18.42(7/38)
ropB:D516V1 1.85(1/54) ropB:S531L 44 81.48(44/54) 1(1.85%) 3
8ropB:H526D 4 7.40(4/54) ropB:H526V 5 9.26(5/54)
表2 92株菌株耐INH、SM和RFD基因检测结果Tab.2 The detection results
of the genes resisitant to INH,SM and RFP of 92 strainsGene Se [η/%(n/n)] Ac[η/%(n/n)] Sp[η/%(n/n)] +PV[η/%(n/n)] -PV[η/%(n/n)] +LR -PRINH
84.88(73/86) 83.70(77/92) 66.67(4/6) 97.33(73/75) 25.53(4/17) 2.55 0.23SM 79.17(38/48) 83.70(77/92) 88.64(39/44) 88.37(38/43) 79.59(39/49) 6.97
0.24RFP 87.10(54/62) 88.04(81/92) 90.00(27/30) 94.74(54/57) 77.14(27/35) 8.71 0.14
2.4 杂交试验的重复性随机选取10个菌株进行3次重复试验，3次结果完全一致，且杂交信号无减弱现象，表明DNA芯片的重复性好，不受时间、批次等因素的影响。

3 讨论
据统计，全球有1/3以上人口受到结核病的威胁，每年新发病例超过900万，而
且MTB的耐多药和多耐药现象已十分普遍，给结核病治疗带来了很大的难度。

因此结核药敏的快速检测，对指导临床用药，提高结核病疗效具有十分重要的意义。

目前快速检测MTB耐药基因一般选用DNA直接测序、PCR-SSCP、PCR-RFLPt
和多重PCR等，但由于操作烦琐、成本昂贵等很难以应用于临床实践。

本研究应
用DNA探针、核酸杂交和酶联显色三基项的技术检测耐药基因，具有较高的灵敏度、准确度和阳性预测值。

操作较简便，结果判读方便，无需特殊仪器，时间耗费短，仅1～2 d即可完成实验。

自1992年Zhang等[8]证实katG基因缺失引起MTB对INH耐药以来，MTB对INH、RFP和SM的耐药分子机制已基本确立。

耐INH与过氧化氢-过氧化物酶的编码基因katG突变或缺失占临床耐药菌株的50%～70%，烯酰还原酶编码基因inhA突变占临床耐药菌株的10%～35%，烷基过氧化氢酶C编码基因ahpc突变及oxyR基因、kasA基因突变等均与MTB耐药有关。

RFP能特异地与RNA聚合酶β亚单位ropB结合，干扰mRNA转录而发挥抗菌作用。

当 ropB发生位点突变、缺失或插入时，ropB与RFP亲和力下降，导致细菌耐药。

约95%RFP耐药
株是由于ropB基因发生改变所致，而ropB突变90%以上发生在507～533位
27个氨基酸密码子(81 bp)组成的区域内。

SM耐药主要是核糖体30s亚基S12
蛋白的编码基因spsL和16sRNA编码基因rrs突变引起。

最常见的为rpsL基因
43位和88位密码子发生AAG-AGG 突变。

耐多药基因是MTB耐多药的分子基础，目前尚未发现单一基因突变引起的耐多药菌株。

一线抗结核药物INH、RFP和SM的耐药基因在本次对比试验中的检测灵敏度，
阳性预测值，符合率与国内外相关报道[1,9-10]相似。

92株临床菌中与传统药敏
比较共有10株假阳性株，占10.87%。

可能与接种时的菌量、菌种老化或是个人
的判定耐药标准不同有关；也可能是每一种药物靶编码基因突变是逐渐积累的结果，很少量的耐药菌能扩增为阳性，但药敏试验并不一定表现为耐药。

本研究中，65株RFP耐药株中有54株发生ropB基因突变，其中S531L区域突变44株，占突变菌株的81.48%，S531L区域的突变是引起RFP耐药的主要原因。

据报道[11]，RFP突变位点有地方性，如在匈牙利、拉脱维亚、印度北部以516
位为主。

531位可以作为长沙地区RPF耐药性的分子标志和多重耐药的筛选指标。

此外，526位的突变也有9株，516位有1株。

还发现1株531和526位同时突变株，但该株的传统药敏显示：其低浓度是高耐药性，高浓度的RFP却对其仍有
杀灭活性。

突变基因数量与耐药程度的关系有待进一步研究。

53株SM耐药株中
检测到38株rpsL基因发生突变，其中43M位突变株有29株，88M位突变株7株，12株未检测到spsL基因。

73株INH耐药株中61株正确检出含有突变基因，占83.56%。

其中katG:315M区域突变株最多，有58株；inhA:-15M区2株，
同时检测到2个基因的有1株。

但仍有13株耐药株未检测到这2种基因，可能是由于耐药基因有其他位点和/或其他基因发生变化而尚未检测到。

综上所述，反向斑点杂交技术在检测MTB对何种药物耐药的同时，还能了解突变的基因及区域，而且总体的敏感度和准确度高，能对结核耐药株进行快速初筛。

但如何增加更多的检测位点，优化实验条件，以减少假阳性和假阴性仍是进一步研究的重点。

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