16S rDNA克隆文库法分析地下水生物反硝化系统细菌种群多样性

16S rDNA克隆文库法分析地下水生物反硝化系统细菌种群
多样性
张建美;李思远;高绣纺;喻笑勇;时序;李根;蒋兴超
【摘要】采集地下水硝酸盐生物反硝化系统内的污泥样品,提取污泥样品中微生物的总DNA,构建细菌16S rDNA基因片段克隆文库,并通过16S rDNA序列系统发育分析,对反硝化系统内的细菌种群多样性以及菌群结构进行了研究.结果表明,地下水生物反硝化系统内细菌具有高度多样性,样品文库分为9个细菌类群,优势菌群为β-Proteobacteria(67.11％)和Bacteroidetes(15.79％),其中,β-proteobacteria 为最优势菌群,以Rhodocyclaceae为主.对反硝化系统内细菌种群多样性的研究有利于确定优势菌种,为地下水硝酸盐生物反硝化修复奠定理论基础.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2014(014)030
【总页数】6页(P283-288)
【关键词】硝酸盐;反硝化细菌;16S rDNA克隆文库法;细菌多样性
【作者】张建美;李思远;高绣纺;喻笑勇;时序;李根;蒋兴超
【作者单位】长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉430100;中国地质大学(北京)水资源与环境学院,北京100083;长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉430100;长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉430100;长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉
430100;长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉430100;长江大学地球环境与水资源学院油气资源与勘探技术教育部重点实验室,武汉430100
【正文语种】中文
【中图分类】X523
由农业氮肥的广泛使用、生活污水及工业废水的不合理排放以及畜牧业的发展等引起的地下水硝酸盐污染已成为一个严重的环境问题[1—4]。

饮用水中硝酸盐含量过高会对人体造成严重危害，容易引起高铁血红蛋白症或诱发癌症[5—8]。

因此，去除地下水中的硝酸盐至关重要。

生物反硝化是指利用微生物的反硝化作用，将最终转化为N2，由于该方法高效低耗，而且能将地下水中的硝酸盐彻底去除，得到了广泛的关注。

目前有关生物反硝化法去除地下水中硝酸盐的研究多集中在有机碳源遴选、环境条件优化以及反硝化机理研究等方面[9—11]，而对在反硝化过程中起重要作用的细菌种群结构的研究较少。

生物群落结构的研究方法以往大多是基于培养和分离纯化的传统方法，然而实验室内可培养的微生物仅占环境中微生物总数的1%～10%[12]，而且在培养过程中容易引起微生物生理特性的改变，难以客观地反映环境中微生物种群的原始状态。

分子生物学的快速发展为从分子水平揭示微生物的种群结构提供了新的方法，其中克隆文库法成为环境中微生物种群结构及多样性的重要研究方法之一。

16S rDNA克隆文库法是通过对16S rDNA全长序列进行扩增、分析，以达到分析样品中微生物种群结构的目的[13]，该方法信息量大、简单便捷，目前已经成为污水生物处理系统中细菌菌群结构研究的主要手段。

本文采用16S rDNA克隆文库法，分析地下水反硝化系统中的细菌菌群结构，确定优势菌群，为地下水硝酸盐反硝化生物修
复奠定理论基础。

1 材料与方法
1.1 反硝化系统样品采集
反硝化实验装置为内径10 cm、高50 cm的有机玻璃柱，柱子在使用前用酒精杀菌。

活性污泥取自某污水处理厂。

取一定量可生物降解塑料(作为反硝化细菌碳源使用)及沸石放入压力蒸汽灭菌器内灭菌15 min，之后放入2 000 mL的污泥中浸泡24 h，混合均匀后填入柱子。

实验用水为合成地下水，其中硝酸盐浓度为50 mg 并向其中加入一定量的KH2PO4，为微生物提供生长所需的磷，N/P=20，进水流量为2 mL·min-1，温度为25 ℃。

系统稳定运行2个月后，连续半月取水样分析。

结果表明，反硝化柱出水硝酸盐浓度在0～0.80 mg 之间，硝酸盐去除率达到98%以上，同时出水亚硝酸盐积累量少，浓度在0～0.01 mg 之间，表明系统内反硝化反应彻底进行，硝酸盐去除率高。

当系统达到稳定运行后，用无菌铁勺从反硝化柱的中间部位取附有生物膜的填料，加入无菌水，超声清洗30 min，取泥水混合液，以12 000 r/min离心得到污泥样品。

之后，取一定量污泥样品，用基因组DNA提取试剂盒(上海生工)提取样品总DNA。

1.2 仪器设备
C1000TM PCR仪(美国Bio-Rad)，DYY—6C电泳槽(北京六一厂)，Universal Hood II PCR凝胶成像仪(美国Bio-Rad)，5417R离心机(德国Eppdorf)，
KH2200 DB数控超声波清洗器(昆山禾创)，SW-CJ-1FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3 实验方法
1.3.1 16S rDNA基因全长PCR 扩增
使用细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’,
M=C or A)以及1492R(5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’, Y=C or T)，扩增样品的目的基因。

PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72°C延伸2 min，总共35个循环，最后在72 ℃下延伸7 min。

PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

图1为16S rDNA 全长扩增结果，泳道3为样品全长扩增样品，C为阴性对照。

由图可知，PCR扩增产物片段大小约为1 500 bp，而且没有多余的条带，即没有非特异性扩增现象，因此得到的PCR扩增产物适于构建16S rDNA克隆文库。

图1 16S rDNA 全长扩增结果Fig.1 Amplified full-length 16S rDNA
1.3.2 载体连接转化和蓝白斑挑选
用pEASY-T1载体(全式金公司)连接PCR产物，然后热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

取不同体积的已转化的感受态细胞加入到含Amp/IPTG/X-Gal的LB培养基上，使细胞均匀涂开，将平板置于37 ℃培养箱内倒置过夜培养16 h。

培养后有菌落出现，在4 ℃下显色。

选择在IPTG/X-Gal平板上生长的白色菌落，挑至含氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃培养16 h，之后4 ℃冰箱内显色，进行蓝白斑挑选以及验证白斑。

之后编号，保存待测序。

1.3.3 系统发育分析
随机选取样品中的阳性克隆由北京中科希林生物技术有限责任公司进行测序。

获得序列后，首先用RDP网站上的Chimera Detection程序进行嵌合体检测，若有嵌合体存在，则将其剔除。

然后利用Dutor软件对所得序列进行分类。

将所得序列与GenBank数据库中已有的序列进行比对分析，选择相似性比较高的序列作为参考。

将所有序列用BioEdit中ClustalW程序比对分析后，用MEGA 4.0软件生成系统发育树。

2 结果和讨论
2.1 样品细菌多样性分析
经过测序共得到76个阳性克隆，将测序结果进行Dotur分析，结果显示，样品共得到35种基因型。

将样品的每种基因型序列输入RDP网站，利用Classifier程序确定系统发育类群。

分析结果表明，样品文库中细菌的76个阳性克隆的16S rDNA序列分属9个细菌类群(图2)，分别为β-Proteobacteria(67.11%)、Bacteroidetes(15.79%)、δ-proteobacteria(3.95%)、Firmicutes(2.63%)、unclassified_Bacteria(2.63%)、OP11(2.63%)、α-proteobacteria(2.63%)、Acidobacteria(1.32%)、γ-proteobacteria(1.32%)。

由数据可知，样品中的优势菌群为β-proteobacteria(β-变形杆菌纲)和Bacteroidetes(拟杆菌纲)，其中β-Proteobacteria为第一大优势细菌。

β-proteobacteria大多为兼具呼吸/发酵代
谢方式的兼性异养菌，以有机物为碳源，是污水处理系统中污染物降解的主要参与者[14,15]。

因此可以判断，在该反硝化系统内β-Proteobacteria对于硝酸盐的降解起到了至关重要的作用。

姜昕等[16]的研究结果同样发现活性污泥系统中的最优势菌群为β-proteobacteria。

此外，其他的研究同样发现脱氮系统的细菌多与β-proteobacteria菌群有关[17]。

由图2可见，δ-proteobacteria(δ-变形杆菌纲)
占了样品文库的3.95%，尽管该类细菌在文库中所占的比例远低于β-proteobacteria菌群，但δ-proteobacteria包括一些严格厌氧的细菌，具有降解COD功能，在该反硝化系统内对硝酸盐的降解仍然能起到一定的作用。

Bacteroidetes(拟杆菌纲)为样品中第二大优势菌种，在文库中所占比例为15.79%。

拟杆菌为大小不同的杆菌，可在厌氧条件下代谢碳水化合物，能将纤维素、淀粉等复杂有机物水解为乳酸、乙酸等小分子物质 [18,19]。

Wagner等[20]同样发现β-Proteobacteria是废水处理系统中的最优势类群，其次是Bacteroidetes。

图2 各类细菌在文库中所占的百分比Fig.2 Proportion of phyla in the clone library表1 反硝化系统中部分细菌16S rDNA序列比对结果Table 1 BLAST analysis of 16S rDNA sequences of bacteria in the denitrification-based
groundwater remediation systems
克隆号基因频率/%系统类群数据库中最接近种或克隆Max ident/%3-352.63β-proteobacte-riaSulfuritalea hydrogenivorans gene from freshwater
lake(AB552842)983-389.21β-proteobacte-riaDechloromonas sp. UNPF85 gene from rice paddy soil(AB696861)993-3911.84β-proteobacte-riaUncultured Rhodocyclaceae bacterium clone B6 from Carrizo shallow lake(HQ003472)983-476.58β-proteobacte-riaBeta proteobacterium A0640 from beta proteobacterium A0640 (AF236010)983-5211.84β-proteobacte-riaUncultured Rhodocyclaceae bacterium clone 408 from activated sludge and fresh wa-ter sediment (FM207908)983-5311.84β-proteobacte-riaUncultured beta proteobacterium clone DFAW-034 from
sludge(AY823978)993-562.63β-proteobacte-riaUncultured beta proteobacterium clone P-R12 from Chongxi wetland soil(JN038802)973-312.63BacteroidetesUncultured Bacteroidetes bacterium clone ESS-H6
from arctic snow(FJ946589)993-332.63BacteroidetesUncultured bacterium clone LD_Ba_TopB16 from active layer(EU644258)983-
452.63BacteroidetesUncultured bacterium clone Pav-072 from meromictic lake(DQ642381)943-322.63FirmicutesUncultured Firmicutes clone
QEDN7CE08 from mesophilic anaerobic digester (CU925545)993-
342.63OP1Uncultured bacterium clone SING477 from Kelike Lake
(HM129123)96
将样品的每种基因型序列输入NCBI网站，与数据库中已有的序列进行比对分析，主要比对结果见表1。

由表可知，与文库中相似性较高的序列大多来自于湖泊、土壤、活性污泥以及沉积物等相关环境，而且大部分为未培养细菌，主要是因为自然
环境中存在着大量不可培养的微生物 [21]，而且靠传统的方法分离培养得到的细
菌并不一定是反硝化系统中的优势细菌[22]。

2.2 样品细菌系统发育分析
为了进一步了解样品中细菌的系统发育地位，按照最大同源性原则，构建样品菌群的系统发育树，图3为样品基于16S rDNA序列的主要微生物类群的系统发育树。

β-proteobacteria在文库中所占比例高达67.11%，大部分为未培养菌种(Uncultured bacterium)，包括7种主要的基因型，分别为克隆3-35、3-38、3-39、3-47、3-52、3-53、3-56，反映了该类群细菌在反硝化系统中起到重要的作用。

其中克隆3-35与来自淡水湖的Sulfuritalea hydrogenivorans菌株的同源性达到了99%。

Sulfuritalea hydrogenivorans菌为在厌氧环境下存活的兼性自养菌，可以以单质硫、氢为能源物质，硝酸盐为电子受体进行生长繁殖[23]。

克隆
3-38与来自水稻土的Dechloromonas sp.同源性达到了99%。

克隆3-39、3-52分别与Uncultured Rhodocyclaceae bacterium克隆同源性达到了98%。

Hesselsoe等[24]研究表明，在活性污泥中Uncultured Rhodocyclaceae bacterium对于氮的转移和硝酸盐还原具有重要作用。

RDP发现β-proteobacteria 中占绝对优势的为红环菌科(Rhodocyclaceae)类细菌，实际上，Sulfuritalea hydrogenivorans、Dechloromonas sp.均属于Rhodocyclaceae 科。

孙彦富等[25]发现，红环菌属能以乙酸钠为电子供体，以为电子受体进行反硝化作用。

洪璇等[26]同样发现，以喹啉为底物的反硝化反应器中Rhodocyclaceae 科的细菌在整个群落中占绝对优势。

由此可以判断，该地下水反硝化系统内Rhodocyclaceae科细菌在硝酸盐的去除过程中起到了重要的作用。

图3 样品基于16S rDNA 序列的菌群系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of bacteria based on 16S rDNA sequences
Bacteroidetes(拟杆菌纲)在文库中所占比例为15.79%，是除β-proteobacteria
外最大的一类菌群，包括3种基因型，即克隆3-31、3-33、3-45，均为未培养的细菌。

3 结论
(1) 样品文库共得到76个阳性克隆，分属于9个细菌类群：β-Proteobacteria (67.11%)、Bacteroidetes (15.79%)、δ-proteobacteria (3.95%)、Firmicutes (2.63%)、unclassified_Bacteria (2.63%)、OP11 (2.63%)、α-proteobacteria (2.63%)、Acidobacteria (1.32%)、γ-proteobacteria (1.32%)。

(2) 样品中优势菌群为β-Proteobacteria和Bacteroidetes，其中β-Proteobacteria为第一大优势菌群。

(3) 在β-proteobacteria中占绝对优势的为Rhodocyclales，对系统内硝酸盐的去除起到了重要的作用。

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