国内外原料乳中金黄色葡萄球菌风险评估研究综述

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国内外原料乳中金黄色葡萄球菌风险评估研究综述
李娇;董庆利;陆柏益;叶兴乾;刘东红;丁甜
【摘要】近年来我国乳品消费量持续增加,乳品质量安全关乎着人们身体健康和生命安全.金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的乳品中毒事件时有发生,逐本求源地针对原料乳开展金黄色葡萄球菌风险评估研究是十分必要的.本文根据国际食品法典委员会拟定的微生物风险评估的原则和指导方针,从危害识别、危害特征描述、暴露评估、风险描述四方面综述了关于原料乳中金黄色葡萄球菌国内外风险评估的研究现状.通过国外成熟的定量风险评估案例,介绍关于原料乳中金黄色葡萄球菌定量风险评估的基本框架,提出未来应加强构建肠毒素预测模型,较为系统的对原料乳从牧场到餐桌进行全程监控和风险评估的建议.
【期刊名称】《乳业科学与技术》
【年(卷),期】2015(038)001
【总页数】6页(P26-31)
【关键词】原料乳;金黄色葡萄球菌;肠毒素;风险评估
【作者】李娇;董庆利;陆柏益;叶兴乾;刘东红;丁甜
【作者单位】浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;浙江大学馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,浙江杭州 310058;浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;浙江大学馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;浙江大学馥莉食品研究院,浙江杭州
310058;浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;浙江大学馥莉
食品研究院,浙江杭州 310058
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
原料乳;金黄色葡萄球菌;肠毒素;风险评估
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是威胁人类健康的四大食源性病原菌之一,其所导致的食物中毒主要是由肠毒素引起的。

在食品中,易被金黄色葡萄球菌污染的食品主要有鱼、肉、蛋、乳及其制品,尤其是原料乳的安全常受到金黄色葡萄球菌肠毒素的威胁,因为原料乳非常容易受乳牛乳腺炎、操作人员、加工环境、器皿所带的金黄色葡萄球菌的污染[1],虽然在后续加工过程中,通过巴氏杀菌或者其他杀菌手段可以杀死金黄色葡萄球菌,然而却未必能有效清除耐热的肠毒素,因此在乳粉、酸乳等乳制品中仍有可能携带肠毒素从而对人们的健康造成危害[2]。

由此可见,逐本求源地针对原料乳开展风险评估研究十分必要。

按照世界卫生组织于2002年通过的全球食品安全战略,当前的食品安全监管当以风险分析为基础,改善风险评估体制、加强风险管理和风险交流,构建持续的综合食品安全系统。

国际食品法典委员会拟定的微生物风险评估的原则和指导方针,分为危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述四部分[3],这也是目前国际上被广泛采纳的一种微生物风险评估框架。

风险评估可分为定性、定量和半定量风险评估3种类型。

国际食品微生物标准委员会曾指出“如果想让危害分析有
意义就必须定量”。

对于金黄色葡萄球菌而言,所谓定量风险评估是根据该菌毒理学特征以及流行病学等资料,确定肠毒素的摄入量及其对人体产生不良作用概率之间关系的数学描述。

它是风险评估最理想的方式,据此结果能更加方便有效地制定风险管理政策。

因此,完善原料乳定量风险评估理论体系,以期适应我国目前安全
食品越来越高的市场需求,为原料乳及乳制品的安全质量监控和相关预警、安全保障体系提供基础信息。

1.1 金黄色葡萄球菌及其肠毒素的生物学特征
金黄色葡萄球菌为球型,无芽胞、无鞭毛、不运动,革兰氏染色阳性[4]。

显微镜检查成单、双、短链、葡萄状排列[5]。

金黄色葡萄球菌能在不同的食物基质中生存繁殖,有高度的耐盐性,生长温度范围为7~48 ℃,最适温度37 ℃,生长所需pH值为4~10,最适生长pH值为7.4[4]。

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcusal enterotoxin,SE)是一种典型的细菌外毒素,主要是由金黄色葡萄球菌在特定的生长条件下合成的。

据统计有50%~75%的金黄色葡萄球菌菌株在合适的环境条件下能够产生肠毒素,且肠毒素在对高温、低pH值等可轻易杀死金黄色葡萄球菌的恶劣环境下具有很强的耐受性,因此危害性较大[6]。

到目前为止,已经鉴定出21种完全不同的金黄色葡萄球菌肠毒素,其中SEA、SEB、SEC、SED、SEE和SEH等主要肠毒素均引起过原料乳及其乳制品污染而导致的中毒事件[7-9],最常见为SEA和SED,SEB 和SEC型次之,有研究表明SEA的毒力最强,引起食物中毒的现象大于75%[10]。

1.2 流行病学研究和监测资料
在危害识别中流行病学研究和监测资料是重要的组成部分,根据这方面的资料进行推断,可得到风险概率。

金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题,2009年欧洲食品安全局报道了5 550例食物中毒的事件,导致49 000人患病、46人死亡。

其中293例金黄色葡萄球菌感染引起,金黄色葡萄球菌为欧洲最常见的4种引发食物中毒的病原菌之一[11]。

2011年美国疾病控制与预防中心报告指出,每年因金黄色葡萄球菌引起的中毒人数为241 148人,由此导致的住院率高达6.4%,是美国最常见的引发
食物中毒的5种食源性致病菌之一[12],每年造成的经济损失达15亿美元[13]。

2013年国家卫生和计划生育委员会在《关于2013年全国食物中毒事件情况的通报》中指出,通过突发公共卫生事件网络直报系统共收到全国食物中毒类突发公共卫生事件报告共152起,中毒5 559人,死亡109人,其中金黄色葡萄球菌在微生物性食品中毒事件中排第3位。

世界卫生组织估计发达国家食源性疾
病的漏报率在90%以上,发展中国家每年的漏报率更高[14],说明虽然仅从监
测数据上看我国的金黄色葡萄球菌中毒事件暴发情况不是很严重,但是考虑到我国目前监测网覆盖范围不全,因此实际暴发数量比监测网中的数据要多得多。

这是我国在金黄色葡萄球菌方面的重点和难点。

原料乳受污染的监测资料方面,美国加州戴维斯大学的VMTRC中心对来自加州
的51 963份牛乳样品分析后发现,金黄色葡萄球菌阳性样品13 157份,阳性率
为25.3%[15]。

我国疾病监测网中21个省/直辖市致病菌监测结果显示,556
份生乳样品中金黄色葡萄球菌阳性样品为122份,阳性率为21.94%,居于所监测的7种致病菌之首[16]。

这表明,原料乳中金黄色葡萄球菌污染较为严重。

2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素对健康的危害
金黄色葡萄球菌肠毒素中毒潜伏期短,一般为2~5 h,起病急。

临床表现为恶心、呕吐,部分病例会出现腹泻和腹部绞痛,症状一般会在24 h内消失[17]。

其致病机制可能是肠毒素直接作用于胃肠黏膜而引起病变[5],同时刺激迷走神经的内脏分支而引起反射性呕吐。

肠毒素是引发呕吐的毒素,但是目前已鉴定的几种肠毒素分型没有催吐活性,其他还在研究之中[18]。

有报道指出,20~100 ng金黄色葡萄球菌肠毒素能引起食物中毒[19]。

症状的严重程度取决于摄入食物量
以及个人健康水平及对毒素的敏感程度[20],一般不会导致死亡,但也有老人、婴幼儿和过度疲劳者等免疫力较差人群的死亡病例[21]。

金黄色葡萄球菌食物
中毒全年皆可发生,但病例暴发常在天气炎热的夏季。

其次,食物中某些成分会对
金黄色葡萄球菌的生长产生影响,如丰富的淀粉和蛋白质就可能增强毒素的产生[22]。

所以,鱼、肉、蛋及乳制品是易被金黄色葡萄球菌污染产生肠毒素的高
危食品。

2.2 剂量-反应关系
剂量-反应关系是危害特征描述的一个重要的组成部分。

金黄色葡萄球菌缺乏剂量-反应模型,因此现有的定量风险评估常拟定5(lg(CFU/mL))菌数浓度作为导致食物中毒的阈值[23],而实际上即便金黄色葡萄球菌的浓度在3(lg
(CFU/mL))时,仍然可能会有肠毒素产生[24]。

在这方面有多项研究报道肠毒素的产生并不仅仅受金黄色葡萄球菌浓度的影响,还受外部环境和自身的综合影响[25]。

目前也有一些研究基于疾病暴发的数据,将不同的肠毒素浓度作为引起食物中毒的阈值:20[26]、94[15]、100 ng[27]。

但是按照统一的剂量评估,会带
来过高或过低的估计结果。

因此,在计算剂量反应关系时,应该注意人群的区分,例如有研究称剂量为17 ng的金黄色葡萄球菌肠毒素可以导致儿童出现临床症状,而一旦达到50 ng则所有年龄段的人群都可能中毒[28]。

总之,目前基于金黄色葡萄球菌数量(CFU/mL)或者统一剂量的肠毒素质量浓度(ng/mL)来进行安全性评估,有一定的局限性。

因此,在金黄色葡萄球菌肠毒
素的定量检测、引起不同群体食物中毒肠毒素含量以及相应的毒理学实验应加强深入研究。

3.1 预测微生物学在金黄色葡萄球菌暴露评估的应用
国内外关于金黄色葡萄球菌风险评估的预测模型有3个水平:初级模型一般都是
采用Gompertz、Logistic、Baranyi模型;其次是二级模型,包括二次响应面方程、Arrhenius方程和平方根模型来描述初级模型参数随环境条件改变而变化[29],或者描述对模型的主要特征(如迟滞期和指数期生长速率)的影响
[30];三级模型方面,大量的微生物动力学模型被构建并得以推广应用,例如
美国农业部、英国食品研究中心和日本国家食品研究所的研究人员已经基于不同的应用目的分别创建开发了Pathogen Modeling Program(PMP)、Combined Data Base for Predictive Microbiology(ComBase)和Microbial Responses Viewer(MRV)等预测微生物数据库[31-32],为相关领域的工作人员应用预
测模型提供了便利。

近些年预测模型在原料乳金黄色葡萄球菌风险评估中的应用也越来越广泛。

赵凤等[33]通过SAS 9.1软件和MATLAB 7.6软件,采用3种方程对不同温度下原料乳中金黄色葡萄球菌生长情况进行模拟,得到了10~18℃条件下其最适生长模型为多形式方程;20~23 ℃条件下为Logistic模型;25~27 ℃条件下为Gompertz模型。

闫军等[34]用麦夸特法和通用全局优化法,分析拟合不同温
度下原料乳中金黄色葡萄球菌生长数据,研究发现Gompertz模型拟合效果最好,并建立了二级模型。

三级模型方面,Lindqvist等[23]在对生乳制成的新鲜干酪中金黄色葡萄球菌的风险评估中应用了FMM对菌的生长进行模拟;Heidinger等[15]在对生乳中金黄色葡萄球菌的风险评估中将PMP和ComBase都纳入使用。

3.2 金黄色葡萄球菌肠毒素的预测模型
在原料乳金黄色葡萄球菌的定量风险评估研究中,合理使用肠毒素模型对肠毒素产生及肠毒素产量变化实施预测,可以使风险评估理论设计更加合理,评估结果更加实际、准确[35]。

到目前为止,较成功的肠毒素模型是由日本学者Fujikawa和Morozumi在灭菌
乳中构建的,在研究中他们修正了Logistic模型并在不同温度下构建了金黄色葡
萄球菌模型和肠毒素模型[29]:P=0.0376t-0.559 ,式中:P为SEA产生速率/(ng/(mL·h));t为温度/℃。

然而受条件所限,并没有考虑更多环境因素对
金黄色葡萄球菌和肠毒素的影响,同时也没有在变温条件下构建更具现实意义的预
测模型。

在实际应用中会受到限制,不能全面、准确地为风险评估提供有效的信息。

因此,目前仍然缺乏一个完善有效的金黄色葡萄球菌肠毒素的预测模型。

3.3 国内原料乳中金黄色葡萄球菌的暴露评估
目前国内在暴露评估方面的研究运用概率评估方法估计原料乳中金黄色葡萄球菌的暴露程度来推断肠毒素产生的可能性。

其构建的过程中风险模型的起点为挤乳结束,终点是运输到乳品厂,整个过程包括贮藏和运输2个阶段[36]。

遇晓杰等[36]对奶牛场及个体奶户的原料乳收购过程进行分析风险评估,以金
黄色葡萄球菌的产毒素阈值(菌数为105CFU/mL)评估风险大小,结果表明个体奶户直接将原料乳送至乳品厂的收购方式产生的肠毒素风险最大,在此过程金黄色葡萄球菌的最终暴露浓度大于105CFU/mL的概率为25.59%。

而奶牛场集中榨乳、个体奶户将原料乳送至奶站再由奶站运至乳品厂的两种收购方式风险相近,金黄色葡萄球菌的最终暴露浓度大于105CFU/mL的概率分别为8.22%、7.16%。

许晓
曦等[37]对榨乳后不同冷却方式、贮存方式、运输方式进行风险评估。

结果表明,个体奶户采取冷水降温方式直接将原料乳送至乳品厂的风险最为严重,金黄色葡萄球菌大于105CFU/mL的概率为7.08%;冰箱降温方式送至奶站的原料乳中
金黄色葡萄球菌的暴露水平较低,超过105CFU/mL的概率为0.79%;其次,夏
天奶牛场榨乳方式的暴露水平比春秋季严重,大于105CFU/mL的概率为4.49%。

这些研究与PMP模型库中金黄色葡萄球菌预测模型以肉汤培养基的纯菌培养相比,在确立最适合预测模型方面更能从实际生产出发,能针对生乳中存在的金黄色葡萄球菌混合菌株研究,能将大量实验数据与多个方程相拟合,更能使模型真实评价乳中微生物的生长速率。

但是微生物暴露评估主要是对消费者所消费的食品中致病菌的数量、细菌毒素含量、膳食的消费情况(如消费量、消费频率等相关信息)进行评估。

国内目前只研究了贮藏和运输这两个阶段的暴露水平,没有系统地对原料乳从牧场到餐桌进行全程监
控和评估,导致评估报告可提供的信息量有限,对乳品消费时包含的金黄色葡萄球菌的数量和肠毒素含量不能做出更精准的预测和分析。

3.4 国外原料乳中金黄色葡萄球菌的暴露评估
众所周知,定量风险评估是风险评估的最理想方式,目前国外在生乳金黄色葡萄球菌定量风险评估方面已取得突破性进展。

Heidinger等[15]建立了一个从资料
收集、分析到定量危害性评估的风险评估技术路线,采用蒙特卡罗模型,用成熟的@RISK软件来实现风险分析,描述了整个“乳厂-消费”的暴露路径,基于原料乳污染水平、消费频率、生长情况、贮藏时间、贮藏温度等参数的可得数据,用先进的预测微生物学模型PMP、ComBase模拟金黄色葡萄球菌的生长情况,运用数
学模型分析假设在温度大于15 ℃、菌株浓度大于105CFU/mL的条件下产生肠毒素A,并且考虑到不产毒菌株的存在以及对产毒菌株的间接影响,用Pert分布对
产毒浓度进行校正使结果更具真实性,从而对不同时间和温度的贮藏条件所存在的风险水平进行量化,并根据乳的消费情况对不同年龄群体摄入肠毒素的中毒风险进行预测。

具体的技术路线见图2。

此技术路线有很多值得国内风险评估借鉴的地方,首先,对乳品污染水平、贮藏温度和时间、消费频率的数据收集完善,而数据收集可能是形成风险暴露模型所需资源中最密集的部分,它涉及影响风险评估的结果和质量等许多问题;其次基于预测微生物学和数学模型的定量风险评估量化了原料乳在生产、加工、消费过程中金黄色葡萄球菌及肠毒素危害,并把这一危害与因其所导致疾病的概率直接联系起来,获得的结果有利于制定风险管理政策。

最后合理使用肠毒素模型对肠毒素产生及肠毒素产量变化实施更准确预测,使风险评估结果更加实际。

4.1 风险评价
风险评价应整合危害识别、危害描述和暴露评估期间收集的信息,以达到估计由于消费被金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染的食品产生的有害后果。

Heidinger等[15]对原料乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素A进行了定量风险评估,模拟了产乳、收购、贮存、运输的条件,生长模型预测生乳在加工前金黄色葡萄球菌生长水平超过105CFU/mL的概率为1/10000~1/1000,存在潜在的消费风险;按照肠毒素剂量在94 ng认为足以引起中毒,肠毒素A产生模型预测暴露在第99.99位点处产生的肠毒素剂量能使所有年龄组的消费者中毒。

刘弘等[38]按微生物风险评估的基本程序,应用澳大利亚的半定量风险评估软件,结合流行病学调查和微生物检测等,对上海市生乳污染金黄色葡萄球菌情况进行半定量风险评估,结果显示风险程度为中等,需加强监管。

Makita等[39]分析了埃塞尔比亚德布雷塞特地区非正式销售原乳和家庭自制酸乳在消费中金黄色葡萄球菌中毒的风险。

金黄色葡萄球菌生长模型分析显示通过传统食品发酵之后能够显著缓解风险出现。

4.2 风险评估中的变异和不确定性
在暴露评估的步骤中采用的预测模型是数学模型,因此变异性是一定存在的。

模型中的参数,如初始污染水平、贮藏时间、贮藏温度、pH值等,它们的变异性对模型的影响很大。

有研究表明,缺乏金黄色葡萄球菌的剂量-反应模型是不确定性的最重要来源[23],其次模型的使用简化了原料乳中金黄色葡萄球菌生长及肠毒素产生的复
杂情况,且没有考虑金黄色葡萄球菌与乳中其他微生物的种类、数量及相互作用。

因此原料乳在真正消费时其中所含金黄色葡萄球菌的数量及肠毒素的含量很难被精准预测。

4.3 敏感性分析
敏感性分析是风险评估中的重要组合部分,用来分析评估过程中主要参数变化对于风险结果的影响,其结果可以作为制定关键控制点的依据,从而得到比较有效的控制措施,将风险降至最低。

研究表明,初始污染水平、贮藏温度、贮藏时间、pH值是影响原料乳中金黄色葡萄球菌风险评估结果的关键性因素,其中初始污染水平的影响最大[40]。

遇晓杰等[36]用@Risk4.5进行敏感性分析得出无论原料乳的的收购方式如何,金黄色葡萄球菌污染的初始浓度都是引起风险的最重要因素。

Lindqvist等[23]对生乳制成的新鲜乳酪分析同样得出,金黄色葡萄球菌的初始浓度对品质影响最大,其次是贮藏温度。

因此,在源头上防止金黄色葡萄球菌的污染,对控制乳品品质起着至关重要的作用。

原料乳的安全风险评估是保障乳品安全的重要工具,是实现“从牧场到餐桌”全程安全质量控制的重要基础。

但我国的食品安全风险评估尚在起步阶段,原料乳中金黄色葡萄球在以下几个方面加强研究:首先,完善各方面数据监测系统,获得高质量的监测数据和大规模的流行病学调查分析及统计资料,为定量风险评估作好数据支撑;其次,由于缺乏金黄色葡萄球菌的剂量-反应关系,在金黄色葡萄球菌肠毒素定量检测和毒理学实验值得加强深入研究;此外,将预测微生物学知识和手段应用到肠毒素的预测和风险评估中是当前的研究热点,具有广阔的前景;最后,加强对定量风险评估框架的理论认识和实践,系统地对原料乳从牧场到餐桌进行全程监控和评估,形成完整模式的风险评估报告,完善对金黄色葡萄球菌及肠毒素的暴露评估及风险描述的工作,努力提高风险评估的有效性和准确性,以期适应我国目前安全食品越来越高的市场需求,为乳品的安全质量监控和相关预警、安全保障体系提供基础信息。

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