蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析
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多数酶解是在碱性条件下进行的 ,所以二硫键 交换的几率比较大 ,虽然用部分酸水解能避免二硫
第6期
ห้องสมุดไป่ตู้
仇晓燕等 蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析
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键交换 ,但是这样得到的数据不容易解释和处理 ;另 外当被分析物有抗酶解性或含有相邻的半胱氨酸并 参与形成二硫键时 ,找不到合适的酶切位点 ,无法通 过传统的蛋白酶解法得到有用的特征片段信息 ;或 者样品量很少 , 难以满足 X 射线衍射与核磁共振法 对样品量的要求 ;或者因富含二硫键而使异构体数 目增多 ,比如含 3 个二硫键理论上就会有 15 个异构 体 ,应用合成对照法也比较困难时 ,可以采用部分还 原测序法[52 —58] 。虽然从热力学的角度分析 , 每个 二硫键都有相同的还原Π氧化潜能 ,理论上被还原剂 还原的机会应是相同的 。但实际上在溶液中不同的 二硫键的还原动力学是不相同的 ,因为蛋白质具有 一定的空间结构 ,二硫键在蛋白质中的分布是各不 相同的 ,其构象能 (conformational energy) 以及与还原 试剂的接近程度也互不相同 ,因而蛋白质中所包含 的二硫键可以被还原剂选择性地还原 。
根据这种最初的对角线电泳概念 ,随后产生出 许多其他的分离及鉴定含有二硫键肽的双向方法 。 例如 ,未经还原和已被还原的酶解肽段混合物分别 通过高效液相色谱法 ( HPLC) 来分离[28 ,44 —46] ,含有二 硫键的肽段由于被还原而在 HPLC 分离时迁移率改 变 ,就像在对角线电泳中偏离对角线的情况一样 。 同样 ,应用质谱分别对没有预先分离的未还原和已 还原的酶解肽段混合物进行分析[24] ,也可以获得二 硫键的相关信息 。
摘 要 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰 ,对稳定蛋白质的空间结构 ,保持及调节其生物活性有 着非常重要的作用 。因此 ,确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面 。 在众多实验方法中 ,现代质谱技术因其操作简单 、快速 、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段 。本文介 绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展 。
2 二硫键定位的主要方法
X 射线晶体衍射法[42] 依赖于纯蛋白高度有序 结晶的形成 ,是确定蛋白质构象最准确的方法 。而 后来的二维 、多维 NMR[43] 的独到之处在于可以在近 似自然生理条件的溶液状态下测出较小蛋白质的构 象 。不过用这两种方法进行二硫键研究时样品量的 要求比较大 ,一些柔性的蛋白质不易得到所需的晶 体 ,并且结构复杂 、分子量较大的蛋白的计算处理和
Key words assignment of disulfide bond ; mass spectrometry ; MSΠMS ; TCEP ; stable isotope labeling
1 引言
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素 、酶 、 免疫球蛋白 、血浆 、抑制剂和毒液等蛋白质中 ,是一 种常见的蛋白质翻译后修饰 。二硫键作为共价键交 联多肽链内或链间的两个半胱氨酸 ,对稳定蛋白质 的空间结构[1 —5] 、维持正确的折叠构象[6 ,7] 、保持及 调节其生物活性[8 —10] 等都有着举足轻重的作用 。因 此 ,确定二硫键在蛋白质中的位置对于鉴定蛋白质 一级结构有着重要的意义 ,是研究含有二硫键结构 的活性多肽Π蛋白质化学结构的重要方面 。定位二
第 20 卷 第 6 期 2008 年 6 月
化 学 进 展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol . 20 No. 6 J une , 2008
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析 3
仇晓燕1 ,2 崔 勐1 刘志强1 刘淑莹1 3 3
(11 中国科学院长春应用化学研究所 长春质谱中心 长春 130022 ; 21 中国科学院研究生院 北京 100039)
关键词 二硫键定位 质谱 串联质谱 三羧乙基膦 稳定同位素标记 中图分类号 : O657163 ; Q51 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2008) 0620975209
Protein Disulfide Bond Determination and Its Analysis by Mass Spectrometry
Changchun 130022 , China ; 21Graduate School of the Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Abstract Disulfide bonds are one of the most common covalent posttranslational modifications of proteins. They play an important role in maintaining the three2dimensional structures of proteins and their biological activities. Therefore , the determination of disulfide bonds becomes an important aspect for obtaining a comprehensive understanding of the chemical structure of a protein. Numerous experimental methods have been developed for the determination of disulfide bonds in proteins. Modern mass spectrometry has developed as an important tool for the analysis of disulfide bond patterns due to its advantages of being simple , rapid and sensitive. Some useful methods for assignment of disulfide bonds in proteins are introduced , the developments and applications of mass spectrometry in this area are reviewed.
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化 学 进 展
第 20 卷
链内二硫键 , 而且包含一对邻位的半胱氨酸 ( Cys A6 , Cys A7) 。1960 年 ,Moore 等[19] 完成牛胰核糖核 酸酶 (RNase) 全序及二硫键分析 。该酶含有 124 个 氨基酸 ,4 个链内二硫键 。这些早期的研究确立了 如今仍在使用的二硫键定位研究的基本思路 ,包括 : (1) 将样品蛋白在避免二硫键重排或交换的条件下 , 尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二 硫键相连的肽段 ; (2) 分离这些肽段混合物 ; (3) 鉴定 分离所得的各个肽段 ; (4) 断开肽段中的二硫键 ; (5) 分析断开二硫键后的肽段 ,与整个氨基酸序列比较 , 推断二硫键的位置 。同时这些早期的研究也提供了 很多相关实验条件的经验[17 —21] 。比如强酸的环境 会促进二硫键的重排 ,在弱碱性条件下进行酶切时 也会产生二硫键的交换 ,因此要小心地控制裂解实 验条件 。后来又有许多关于二硫键在碱性 pH 条件 下交换反应增强的报道[22 —30] 。但是在酸性条件下 蛋白构象趋于展开从而更容易在半胱氨酸残基之间 断裂 ,所以提议采用酸水解或胃蛋白酶 (pepsin) 酶 解[19 ,22 ,24] 。酸水解法特异性不强 ,对较大蛋白和肽 不合适 。胃蛋白酶可以在酸性条件下使用 ,其专一 性较低 ,断裂位点多 ,所以也更容易在半胱氨酸残基 之间断裂 ,生成的含二硫键肽段比较小 ,有利于后面 的分离和鉴定 。
解谱也会非常复杂 。 对角线电泳 (diagonal electrophoresis) 是一种经典
的二硫键定位分析方法[22] 。这种技术包括 : (1) 胃 蛋白酶酶切未经还原的蛋白质 ; (2) 在酸性 pH = 615 的条件下进行第一向电泳 ,酶解产物肽段将按其大 小及电荷的不同而分离 ; (3) 将滤纸暴露在过甲酸 (CHOOOH) 蒸气中 ,使二硫键氧化断裂 ,并进一步氧 化成磺酸基 ( —SO3 H) ,被氧化的半胱氨酸称为磺基 丙氨酸 ; (4) 将滤纸旋转 90°角 ,在与第一向完全相同 的条件下进行第二向电泳 。无二硫键的肽不受酸的 作用而在两向电泳中迁移率相等 ,将位于一条对角 线上 。那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧 化 ,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同 ,将 偏离对角线 。肽斑可通过茚三酮显色来确定 。将含 磺基丙氨酸的肽段分别取下 ,进行氨基酸序列分析 , 推断二硫键的位置 。如果蛋白质中存在其他未成二 硫键的半胱氨酸 ,要先用碘乙酰胺封闭其 —SH 后再 酶解 。此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化 ,这样可 能会增加分析的复杂性 。
当蛋白质分子中存在二硫键时 ,在完成其氨基 酸测序分析后 ,需要对二硫键的位置加以确定。 1955 年 Ryle 等[17 ,18] 对胰岛素二硫键结构的分析是 蛋白质化学研究史中的里程碑 。胰岛素分子的 A 、B 两链通过两个链间二硫键连在一起 ,A 链还有一个
收稿 : 2007 年 7 月 , 收修改稿 : 2007 年 9 月 3 国家自然科学基金项目 (No1 30672600 , 20675079) 资助 3 3 通讯联系人 e2mail :syliu19 @yahoo. com. cn
另外象 Edman 降解 ( Edman degradation) [13] 或氨 基酸序列分析 (amino acid analysis) [19 ,47] 等二硫键分 析技术样品用量较大 ,对样品纯度要求很高 ,所以纯 化的手段也非常重要 ,纯化过程中所涉及的条件也 必须 主 意 避 免 二 硫 键 的 重 排 和 交 换[18 ,19 ,22 ,28 ,44 —46 ,48 —51] 。一 般 化 学 裂 解 的 肽 段 较 大 , 适合于自动测序仪采用标准 Edman 降解测序方法 测定 。化学法常用试剂有溴化氢 、亚碘酰基苯甲酸 和羟胺等 。酶法的优点是专一性强 、产率较高 、副反 应少 。常用酶有胰蛋白酶 、胰凝乳蛋白酶 、胃蛋白酶 和嗜热菌蛋白酶等 。有时为得到只含一对二硫键的 肽片段 ,可以利用多种酶或化学试剂进行多步酶切 或 化 学 降 解 ( multiple2step enzymatic or chemical digestion) 来裂解蛋白质 。
Qiu Xiaoyan1 ,2 Cui Meng1 Liu Zhiqiang1 Liu Shuying1 3 3 (11Changchun Center of Mass Spectrometry , Changchun Institute of Applied Chemistry , Chinese Academy of Sciences ,
硫键还将有助于我们进一步揭示蛋白的高级结构及 其生物功能[11] ,指导定向化学合成和审评基因工程 重组蛋白的折叠[12 —14] ,便于 X 射线晶体衍射法 ( X2 ray crystallography) 的三维结构研究[15] 以及为通过核 磁共振波谱法 (NMR) 正确解析溶液中的构象奠定 基础[16] 。
目前常用的定位二硫键的主要方法分为非片段 法和片段法 :非片段法包括 X 射线衍射晶体结构解 析法 、多维核磁共振波谱法和合成对照法[31 —34] 等 ; 片段 法 包 括 对 角 线 法 、二 硫 键 异 构 及 突 变 分 析 法[35] 、酶解法和化学裂解法 、部分还原测序法以及 氰化半胱氨酸裂解法等 。它们各具特色 , 也有各自 的局限性 。随着质谱仪器在质量检测范围 、分辨率 、 灵敏度 、准确度和分析速度等方面的不断发展 ,从而 使质 谱 法[26 ,36 —41] 更 加 适 合 于 蛋 白 质 和 肽 的 分 析 。 实践中 ,二硫键的定位多采用生化 、质谱及测序等多 种方法相结合来进行 。本文对二硫键定位分析的一 些方法以及质谱在其中的应用进行了评述 。
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键交换 ,但是这样得到的数据不容易解释和处理 ;另 外当被分析物有抗酶解性或含有相邻的半胱氨酸并 参与形成二硫键时 ,找不到合适的酶切位点 ,无法通 过传统的蛋白酶解法得到有用的特征片段信息 ;或 者样品量很少 , 难以满足 X 射线衍射与核磁共振法 对样品量的要求 ;或者因富含二硫键而使异构体数 目增多 ,比如含 3 个二硫键理论上就会有 15 个异构 体 ,应用合成对照法也比较困难时 ,可以采用部分还 原测序法[52 —58] 。虽然从热力学的角度分析 , 每个 二硫键都有相同的还原Π氧化潜能 ,理论上被还原剂 还原的机会应是相同的 。但实际上在溶液中不同的 二硫键的还原动力学是不相同的 ,因为蛋白质具有 一定的空间结构 ,二硫键在蛋白质中的分布是各不 相同的 ,其构象能 (conformational energy) 以及与还原 试剂的接近程度也互不相同 ,因而蛋白质中所包含 的二硫键可以被还原剂选择性地还原 。
根据这种最初的对角线电泳概念 ,随后产生出 许多其他的分离及鉴定含有二硫键肽的双向方法 。 例如 ,未经还原和已被还原的酶解肽段混合物分别 通过高效液相色谱法 ( HPLC) 来分离[28 ,44 —46] ,含有二 硫键的肽段由于被还原而在 HPLC 分离时迁移率改 变 ,就像在对角线电泳中偏离对角线的情况一样 。 同样 ,应用质谱分别对没有预先分离的未还原和已 还原的酶解肽段混合物进行分析[24] ,也可以获得二 硫键的相关信息 。
摘 要 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰 ,对稳定蛋白质的空间结构 ,保持及调节其生物活性有 着非常重要的作用 。因此 ,确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面 。 在众多实验方法中 ,现代质谱技术因其操作简单 、快速 、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段 。本文介 绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展 。
2 二硫键定位的主要方法
X 射线晶体衍射法[42] 依赖于纯蛋白高度有序 结晶的形成 ,是确定蛋白质构象最准确的方法 。而 后来的二维 、多维 NMR[43] 的独到之处在于可以在近 似自然生理条件的溶液状态下测出较小蛋白质的构 象 。不过用这两种方法进行二硫键研究时样品量的 要求比较大 ,一些柔性的蛋白质不易得到所需的晶 体 ,并且结构复杂 、分子量较大的蛋白的计算处理和
Key words assignment of disulfide bond ; mass spectrometry ; MSΠMS ; TCEP ; stable isotope labeling
1 引言
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素 、酶 、 免疫球蛋白 、血浆 、抑制剂和毒液等蛋白质中 ,是一 种常见的蛋白质翻译后修饰 。二硫键作为共价键交 联多肽链内或链间的两个半胱氨酸 ,对稳定蛋白质 的空间结构[1 —5] 、维持正确的折叠构象[6 ,7] 、保持及 调节其生物活性[8 —10] 等都有着举足轻重的作用 。因 此 ,确定二硫键在蛋白质中的位置对于鉴定蛋白质 一级结构有着重要的意义 ,是研究含有二硫键结构 的活性多肽Π蛋白质化学结构的重要方面 。定位二
第 20 卷 第 6 期 2008 年 6 月
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PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol . 20 No. 6 J une , 2008
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析 3
仇晓燕1 ,2 崔 勐1 刘志强1 刘淑莹1 3 3
(11 中国科学院长春应用化学研究所 长春质谱中心 长春 130022 ; 21 中国科学院研究生院 北京 100039)
关键词 二硫键定位 质谱 串联质谱 三羧乙基膦 稳定同位素标记 中图分类号 : O657163 ; Q51 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2008) 0620975209
Protein Disulfide Bond Determination and Its Analysis by Mass Spectrometry
Changchun 130022 , China ; 21Graduate School of the Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Abstract Disulfide bonds are one of the most common covalent posttranslational modifications of proteins. They play an important role in maintaining the three2dimensional structures of proteins and their biological activities. Therefore , the determination of disulfide bonds becomes an important aspect for obtaining a comprehensive understanding of the chemical structure of a protein. Numerous experimental methods have been developed for the determination of disulfide bonds in proteins. Modern mass spectrometry has developed as an important tool for the analysis of disulfide bond patterns due to its advantages of being simple , rapid and sensitive. Some useful methods for assignment of disulfide bonds in proteins are introduced , the developments and applications of mass spectrometry in this area are reviewed.
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化 学 进 展
第 20 卷
链内二硫键 , 而且包含一对邻位的半胱氨酸 ( Cys A6 , Cys A7) 。1960 年 ,Moore 等[19] 完成牛胰核糖核 酸酶 (RNase) 全序及二硫键分析 。该酶含有 124 个 氨基酸 ,4 个链内二硫键 。这些早期的研究确立了 如今仍在使用的二硫键定位研究的基本思路 ,包括 : (1) 将样品蛋白在避免二硫键重排或交换的条件下 , 尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二 硫键相连的肽段 ; (2) 分离这些肽段混合物 ; (3) 鉴定 分离所得的各个肽段 ; (4) 断开肽段中的二硫键 ; (5) 分析断开二硫键后的肽段 ,与整个氨基酸序列比较 , 推断二硫键的位置 。同时这些早期的研究也提供了 很多相关实验条件的经验[17 —21] 。比如强酸的环境 会促进二硫键的重排 ,在弱碱性条件下进行酶切时 也会产生二硫键的交换 ,因此要小心地控制裂解实 验条件 。后来又有许多关于二硫键在碱性 pH 条件 下交换反应增强的报道[22 —30] 。但是在酸性条件下 蛋白构象趋于展开从而更容易在半胱氨酸残基之间 断裂 ,所以提议采用酸水解或胃蛋白酶 (pepsin) 酶 解[19 ,22 ,24] 。酸水解法特异性不强 ,对较大蛋白和肽 不合适 。胃蛋白酶可以在酸性条件下使用 ,其专一 性较低 ,断裂位点多 ,所以也更容易在半胱氨酸残基 之间断裂 ,生成的含二硫键肽段比较小 ,有利于后面 的分离和鉴定 。
解谱也会非常复杂 。 对角线电泳 (diagonal electrophoresis) 是一种经典
的二硫键定位分析方法[22] 。这种技术包括 : (1) 胃 蛋白酶酶切未经还原的蛋白质 ; (2) 在酸性 pH = 615 的条件下进行第一向电泳 ,酶解产物肽段将按其大 小及电荷的不同而分离 ; (3) 将滤纸暴露在过甲酸 (CHOOOH) 蒸气中 ,使二硫键氧化断裂 ,并进一步氧 化成磺酸基 ( —SO3 H) ,被氧化的半胱氨酸称为磺基 丙氨酸 ; (4) 将滤纸旋转 90°角 ,在与第一向完全相同 的条件下进行第二向电泳 。无二硫键的肽不受酸的 作用而在两向电泳中迁移率相等 ,将位于一条对角 线上 。那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧 化 ,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同 ,将 偏离对角线 。肽斑可通过茚三酮显色来确定 。将含 磺基丙氨酸的肽段分别取下 ,进行氨基酸序列分析 , 推断二硫键的位置 。如果蛋白质中存在其他未成二 硫键的半胱氨酸 ,要先用碘乙酰胺封闭其 —SH 后再 酶解 。此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化 ,这样可 能会增加分析的复杂性 。
当蛋白质分子中存在二硫键时 ,在完成其氨基 酸测序分析后 ,需要对二硫键的位置加以确定。 1955 年 Ryle 等[17 ,18] 对胰岛素二硫键结构的分析是 蛋白质化学研究史中的里程碑 。胰岛素分子的 A 、B 两链通过两个链间二硫键连在一起 ,A 链还有一个
收稿 : 2007 年 7 月 , 收修改稿 : 2007 年 9 月 3 国家自然科学基金项目 (No1 30672600 , 20675079) 资助 3 3 通讯联系人 e2mail :syliu19 @yahoo. com. cn
另外象 Edman 降解 ( Edman degradation) [13] 或氨 基酸序列分析 (amino acid analysis) [19 ,47] 等二硫键分 析技术样品用量较大 ,对样品纯度要求很高 ,所以纯 化的手段也非常重要 ,纯化过程中所涉及的条件也 必须 主 意 避 免 二 硫 键 的 重 排 和 交 换[18 ,19 ,22 ,28 ,44 —46 ,48 —51] 。一 般 化 学 裂 解 的 肽 段 较 大 , 适合于自动测序仪采用标准 Edman 降解测序方法 测定 。化学法常用试剂有溴化氢 、亚碘酰基苯甲酸 和羟胺等 。酶法的优点是专一性强 、产率较高 、副反 应少 。常用酶有胰蛋白酶 、胰凝乳蛋白酶 、胃蛋白酶 和嗜热菌蛋白酶等 。有时为得到只含一对二硫键的 肽片段 ,可以利用多种酶或化学试剂进行多步酶切 或 化 学 降 解 ( multiple2step enzymatic or chemical digestion) 来裂解蛋白质 。
Qiu Xiaoyan1 ,2 Cui Meng1 Liu Zhiqiang1 Liu Shuying1 3 3 (11Changchun Center of Mass Spectrometry , Changchun Institute of Applied Chemistry , Chinese Academy of Sciences ,
硫键还将有助于我们进一步揭示蛋白的高级结构及 其生物功能[11] ,指导定向化学合成和审评基因工程 重组蛋白的折叠[12 —14] ,便于 X 射线晶体衍射法 ( X2 ray crystallography) 的三维结构研究[15] 以及为通过核 磁共振波谱法 (NMR) 正确解析溶液中的构象奠定 基础[16] 。
目前常用的定位二硫键的主要方法分为非片段 法和片段法 :非片段法包括 X 射线衍射晶体结构解 析法 、多维核磁共振波谱法和合成对照法[31 —34] 等 ; 片段 法 包 括 对 角 线 法 、二 硫 键 异 构 及 突 变 分 析 法[35] 、酶解法和化学裂解法 、部分还原测序法以及 氰化半胱氨酸裂解法等 。它们各具特色 , 也有各自 的局限性 。随着质谱仪器在质量检测范围 、分辨率 、 灵敏度 、准确度和分析速度等方面的不断发展 ,从而 使质 谱 法[26 ,36 —41] 更 加 适 合 于 蛋 白 质 和 肽 的 分 析 。 实践中 ,二硫键的定位多采用生化 、质谱及测序等多 种方法相结合来进行 。本文对二硫键定位分析的一 些方法以及质谱在其中的应用进行了评述 。