禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及DON毒素合成的影响

第54卷㊀第6期河南农业大学学报
Vol.54㊀No.62020年㊀㊀12月
Journal of Henan Agricultural University
Dec.㊀
2020
收稿日期:2020-08-02
基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFD0401404,2017YFC1600903);国家自然科学基金项目(31772023);河南省自然科学基金项目
(182300410059)
作者简介:薛晓雯(1995 ),女,山西原平人,硕士研究生,主要从事食品加工与安全方面研究㊂通信作者:翟焕趁(1975 ),女,河南濮阳人,讲师,博士㊂
文章编号:1000-2340(2020)06-0985-10
禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及
DON 毒素合成的影响
薛晓雯,翟焕趁,屈建航,张帅兵,吕扬勇,李娜,
魏闪,马平安,蔡静平,胡元森
(河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001)
摘要:为探究盐胁迫调控因子和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases ,MAPK )信号途径对
盐胁迫的响应,以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum )为研究对象,应用生物信息学对禾谷镰刀菌FgNST1和Fg-MGV1保守域及其同源蛋白进行分析,采用酵母双杂交和荧光定量PCR 分析了FgNST1和FgMGV1之间的相互关系,并检测了FgNST1基因对DON 毒素的影响㊂结果表明,FgNST1含有盐胁迫负调控因子保守域,FgMGV1含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化中心(Serine /Threonine protein kinase catalytic center ,STKc )保守域;FgNST1与
黄色镰刀菌的胁迫反应蛋白相似度最高㊂FgNST1与FgMGV1可以相互作用,在盐胁迫下FgNST1基因表达下调,而FgMGV1基因表达上调㊂在无盐胁迫下FgMGV1基因在FgNST1敲除突变体中几乎不表达,在盐胁迫下FgMGV1基因在FgNST1敲除突变体中的相对表达量高于野生型菌株㊂盐胁迫抑制禾谷镰刀菌在小麦基质中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol ,DON )毒素合成㊂在无盐胁迫的小麦基质培养基中,FgNST1敲除突变体在产毒初期产生的DON 毒素显著高于野生型,7d 后则显著低于野生型;在盐胁迫的小麦基质中,FgNST1敲除突
变体产生的DON 毒素始终高于野生型菌株㊂
关键词:禾谷镰刀菌;脱氧雪腐镰刀菌烯醇;调控;盐胁迫;促分裂原活化蛋白激酶中图分类号:S435.121㊀㊀㊀㊀文献标志码:A
Effects of Fusarium graminearum FgNST1on FgMGV1
and the synthesis of DON toxin
XUE Xiaowen,ZHAI Huanchen,QU Jianhang,ZHANG Shuaibing,LÜYangyong,LI Na,
WEI Shan,MA Ping an,CAI Jingping,HU Yuansen
(College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)
Abstract :To explore the response of salt stress regulatory factors and MAPK (mitogen activated pro-tein kinases)signal pathways to salt stress,Fusarium graminearum was used as research material.The conserved domain and homologous proteins of NST1(negative for salt tolerance)and MGV1(map ki-nase for growth and virulence 1)of Fusarium graminearum were analyzed based on the bioinformatics.
The relationship between FgNST1and FgMGV1was revealed by yeast two-hybrid and fluorescent quan-titative PCR.The effect of FgNST1on DON toxin synthesis was also detected.The results showed that the FgNST1contained the conserved domain of salt stress negative regulator factors,and the FgMGV1contained the conserved domain of Serine /Threonine protein kinase catalytic center (STKc).FgNST1
986
㊀河㊀南㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第54卷had the highest similarity with the stress response protein of Fusarium culmorum.FgNST1could inter-act with FgMGV1.The gene expression level of FgNST1was down-regulated under salt stress,while the FgMGV1was up-regulated.FgMGV1was hardly expressed in FgNST1knockout mutants in the ab-sence of salt stress,but the expression level of FgMGV1was higher than that in the wild type under salt stress.DON toxin assay indicated that the salt stress inhibited the DON toxin synthesis in wheat sub-strates.Without salt stress in wheat matrix,the FgNST1knockout mutant produced DON toxin signifi-cantly higher than the wild type at initial stage,but was obviously lower than the wild type after7 days.Under salt stress in wheat matrix,the FgNST1knockout mutant always produced higher DON toxin than the wild type.
Key words:Fusarium graminearum;Deoxynivalenol;regulation;salt stress;mitogen activated pro-tein kinase
㊀㊀禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小麦㊁水稻和大麦等禾谷类作物赤霉病的主要致病菌,不仅造成作物产量降低,而且产生多种真菌毒素,严重威胁人畜和食品的安全[1]㊂随着全球气候变暖以及秸秆还田和轮作等耕作方式的改变,赤霉病在世界各地频发,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxyni-valenol,DON)毒素污染日趋严重[2-3]㊂DON毒素的生物合成不仅受细胞外环境因素如水活度㊁温度[4]㊁碳源[5]㊁pH值[6]㊁氮源[7]和过氧化氢[8]等因素的影响,也受细胞内信号途径如环磷酸腺苷蛋白激酶途径[9]㊁雷帕霉素信号转导途径[10]㊁促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)[11]等信号通路的调控㊂MAPK信号途径是生物快速适应环境的变化而产生的一系列蛋白质级联反应,在真核生物中具有高度保守性[12-13]㊂禾谷镰刀菌通过3个MAPK调控菌体的生长㊁侵染㊁有性生殖和对不同胁迫的适应性[14]㊂其中, GPMK1参与信息素信号途径,FgHOG1参与高渗透性甘油(high osmolarity glycerol,HOG)信号途径,MGV1参与细胞壁完整性(cell wall integrity, CWI)途径[15]㊂MGV1基因是禾谷镰刀菌中最先被发现的编码MAPK的基因,缺失该基因会导致菌丝生长和侵染植物的功能严重缺陷,且明显降低DON毒素的生物合成[16]㊂为了满足细胞的生理需要,不同MAPK信号途径之间存在着交互作用[17]㊂禾谷镰刀菌中FgHOG1基因被敲除后,通过过度激活GPMK1激酶影响与CWI和渗透调节相关的基因,最终抑制mgv1突变体的部分缺陷[15]㊂
盐胁迫负调控因子NST1其基因最早是在酵母菌中被分离出来的㊂NST1基因功能的获得引起酵母菌对盐耐受的降低,缺失NST1基因则引起相反的表型,表明该基因在酵母菌中对耐盐性有负影响[18]㊂LENG等[19]研究表明,在酵母菌中NST1介导STE11(参与HOG信号途径和信息素信号途径)和MKK1(CWI途径)的相互作用,从而将HOG 途径㊁信息素途径和CWI途径这3个MAPK信号途径联系起来㊂朱丽红[20]在研究小麦赤霉病及镰刀菌DON毒素调控过程中发现,禾谷镰刀菌也存在NST1基因,并证明禾谷镰刀菌NST1基因缺失突变体对小麦的致病性有显著影响㊂中国小麦赤霉病的发生有明确的区域性,发病区域与年均降雨量和大气湿度等气候变化相关,降雨量较少的年份及低湿度地区小麦DON毒素污染比率较低,通常的解释是镰刀菌生长需要高湿环境,但从分子代谢层面并没有明确的答案[21]㊂作为盐胁迫调控因子,NST1对小麦赤霉病发生和DON毒素的产生是否具有直接的影响尚未见到相关报道㊂另外,通过研究禾谷镰刀菌NST1的功能㊁探讨NST1与其他蛋白的相互关系及对DON毒素合成的影响,将有助于更深入地解析小麦赤霉病发生机制及禾谷镰刀菌DON毒素合成的调控机制㊂本研究分析了禾谷镰刀菌FgNST1与MAPK信号途径中FgMGV1的相互作用关系,并利用已经构建的FgNST1基因敲除突变体探讨FgNST1对DON毒素生物合成的影响㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料
1.1.1㊀供试材料㊀禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1由福建农林大学功能基因组学研究中心惠赠; FgNST1基因(FGSG_04069)敲除突变体,命名为әFgNST1,由河南工业大学微生物学研究室构建保存;酵母双杂交所用菌株和载体购自美国Clo-tech公司㊂试验中涉及的菌株代号及培养条件如表1所示㊂
第6期薛晓雯,等:禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及DON毒素合成的影响987
㊀
表1㊀菌株代号与培养条件
Table1㊀Strain code and culture conditions
菌株代号
Strain code菌株Strain培养条件
Culture conditions WT野生型菌株PH-1不含NaCl培养基WN野生型菌株PH-1含1.0mol㊃L-1NaCl培养基KRәFgNST1突变体不含有NaCl培养基KNәFgNST1突变体含1.0mol㊃L-1NaCl培养基1.1.2㊀试剂及仪器㊀大肠杆菌DH5α感受态细胞和酵母质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,SanPrep柱式质粒抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司,呕吐毒素ELISA检测试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司,PrimeStar GXL DNA polymerase㊁RNA提取Trizol试剂㊁反转录试剂盒㊁荧光定量PCR试剂盒购自TakaRa生物公司,内切酶购自NEB(北京)有限公司,PCR扩增酶和ClonExpress II One step克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司㊂
5427R冷冻离心机(Eppendorf中国有限公司)㊁PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司)㊁StepOneTM实时定量PCR仪(美国应用生物系统公司)㊁DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)㊁NanoDrop2000核酸浓度检测仪(赛默飞世尔科技公司)㊁KMF(E2.5)BINDER培养箱(德国BINDER 公司)㊁QYC-2102C摇床(上海福玛实验设备有限公司)㊂
1.1.3㊀培养基㊀CM液体培养基:酵母粉6g,酸水解酪蛋白6g,蔗糖10g,用蒸馏水定容至1L,灭菌;SD培养基:缺失腺嘌呤(Ade)㊁组氨酸(His)㊁亮氨酸(Leu)和色氨酸(Trp)的DO添加剂(DO supplement-Ade,-His,-Leu,-Trp,美国Sigma公司) 0.067g,无氨基氮源0.67g,双蒸水95mL,灭菌冷却后加5mL质量分数40%的葡萄糖溶液,固体培养基再另加琼脂粉2g;SD/-Trp/-Leu培养基:SD 培养基加800μL100x Ade㊁200μL500x His; SD/-Trp/-Ade培养基:SD培养基加1mL100x Leu㊁200μL500x His;SD/-Leu/-Ade培养基:SD 培养基加200μL500x Trp㊁200μL500x His;SD/-Leu/-His培养基:SD培养基加200μL500x Trp㊁800μL100x Ade;SD/-Trp/-His培养基:SD培养基加1mL100x Leu㊁800μL100x Ade;SD/-Leu 培养基:SD培养基加800μL100x Ade㊁200μL 500x His㊁200μL500x Trp;SD/-Trp培养基:SD 培养基加800μL100x Ade㊁200μL500x His㊁1mL100x Leu;小麦基质培养基:参照孟瑶等[22]方法制备,调节小麦子粒水分质量分数25.0%,分装50g于250mL的三角瓶中㊂
1.2㊀试验方法
1.2.1㊀基因的序列分析㊀根据酿酒酵母菌NST1基因㊁SLT2基因的核苷酸序列在NCBI数据库中进行比对分析,获得禾谷镰刀菌菌株PH-1中的NST1㊁MGV1基因及编码蛋白的序列,利用NCBI CDD数据库(https:/// Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析2种编码蛋白的保守域;通过BlastP比对出其他真菌中与禾谷镰刀菌NST1同源的蛋白,利用MEGA7.0软件对同源蛋白多序列比对,基于邻接法(neighbor joining,NJ)法构建系统发育树,Bootstrap重复次数1000㊂1.2.2㊀禾谷镰刀菌总RNA提取和cDNA合成㊀参照SELVARAJ等[2]方法,将-80ħ保存的禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1的孢子活化后的菌丝块接种至CM液体培养基中,28ħ,150r㊃min-1摇床培养3d,将菌丝进行过滤,研磨后利用TaKaRa RNAiso试剂盒说明书提取纯化RNA,利用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,运用核酸检测仪检测RNA的浓度和纯度,利用反转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA,置于-20ħ保存备用㊂1.2.3㊀重组载体的构建㊀FgNST1基因(FGSG_ 04069,NCBI数据库https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/?term=FGSG_04069)和FgMGV1基因(FGSG_10313,NCBI数据库https://www.ncbi. /gene/?term=FGSG_10313)的cDNA 序列进行引物设计(表2),以野生型的cDNA为模板分别扩增FgNST1基因和FgMGV1基因片段, PCR产物经纯化回收备用㊂酵母表达载体pG-BKT7质粒利用NdeI和BamHI进行双酶切, pGADT7质粒用NdeI和EcoRI进行双酶切,酶切体系为50.0μL(Cutsmart buffer5.0μL,限制性内切酶20U,质粒1.0μg,ddH2O补足至50.0μL), 37ħ水浴4h,纯化回收线性化载体㊂采用无缝克隆方法将FgMGV1片段与线性化载体pGBKT7连接㊁将FgNST1片段与线性化载体pGADT7进行连接,具体操作方法参照ClonExpress II One step Clo-ning Kit说明书执行,将10.0μL连接产物克隆至大肠杆菌DH5α感受态细胞,将含有重组质粒的菌液送去测序,序列正确即证明重组载体构建成功,分别命名为重组载体pGBKT7-FgMGV1㊁pGADT7-FgNST1㊂
988
㊀河㊀南㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第54卷
表2㊀PCR扩增引物序列
Table2㊀Primers sequences of PCR amplification
引物名称Name of primer 序列(5ᶄ 3ᶄ)
Sequences(5ᶄ 3ᶄ)
退火温度/ħ
Annealing
temperature
扩增长度/bp
Amplification
length
WFNST1F GTACCAGATTACGCT CATATG ATGCCGCCAACAACCAAA-
GA57819 WFNST1R ATGCCCACCCGGGT GAATT CTCCTTCGCCTTGATTTGCGAA
WFHMGV1F TCAGAGGAGGACCTG CATATG ATGGGCGACCTACAAG-
GACG591251
WFHMGV1R TCGACGGATCCCCGG GAATTC TTATCTTCGAGAAGCATC-
CAGGC
RMGV1F TACATCCACTCCGCAAACG60233 RMGV1R CCAACAGACCAAACATCAATAGC
㊀注:黑色加粗部分为酶切位点,斜体部分为与载体同源序列㊂
㊀Note:The bold black parts are the restriction site and the italic parts are the homologous sequence with the vector.
1.2.4㊀重组质粒的细胞毒性和自激活检测㊀将构建好的重组质粒pGBKT7-FgMGV1㊁pGADT7-FgNST1分别转化入酵母菌AH109感受态细胞,空载体pGBKT7㊁pGADT7做对照,酵母感受态细胞的制备和转化参照MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统说明书进行,转化子通过质粒酶切进行验证㊂将pGBKT7-FgMGV1转化子单菌落接种于SD/-Trp (卡那霉素抗性)液体培养基,pGADT7-FgNST1转化子接种于SD/-Leu(氨苄青霉素抗性)液体培养基中,30ħ摇床150r㊃min-1培养24h后,通过紫外分光光度计测定OD600判定细胞毒性㊂将pGADT7-NST1转化子菌液分别划线在SD/-Leu㊁SD/-Leu/-Ade㊁SD/-Leu/-His㊁SD/-Leu/X-α-Gal平板上,将pGBKT7-MGV1转化子菌液分别划线于SD/-Trp㊁SD/-Trp/-Ade㊁SD/-Trp/-His㊁SD/-Trp/X-α-Gal平板上,pGADT7-RecT+pGBKT7-P53作为阳性对照,pGADT7㊁pGBKT7分别作为阴性对照, 30ħ培养3d,观察菌落生长情况,检测重组质粒的自激活情况㊂
1.2.5㊀FgMGV1与FgNST1的相互作用检测㊀将pGADT7-FgNST1质粒和pGBKT7-FgMGV1质粒共转化AH109感受态细胞,通过SD/-Leu/-Trp平板筛选阳性转化子pGADT7-NST1+pGBKT7-MGV1,通过酵母质粒酶切验证后,将转化子菌液划线至SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal平板上,以pGADT7-RecT+pGBKT7-P53做阳性对照,pGADT7-RecT+pGBKT7-Lam㊁pGADT7+pGBKT7㊁pGADT7-FgNST1+pGBKT7㊁pGADT7+pGBKT7-FgMGV1为阴性对照,30ħ培养3d,观察菌落能否生长和是否变蓝色㊂
1.2.6㊀DON毒素的测定㊀将活化的禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1㊁әFgNST1突变体菌丝分别接种到灭菌的含NaCl(0㊁1.0mol㊃L-1)小麦基质培养基中,静置于28ħ培养箱培养,每天振荡5min,使病菌发酵均匀㊂测定7㊁14㊁21㊁28d时小麦基质中的DON毒素,检测方法参照华安麦科呕吐毒素ELISA测定试剂盒说明书进行㊂每个样品设置3个平行,试验重复3次㊂
1.2.7㊀FgMGV1基因的实时定量表达分析㊀将活化的禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1㊁әFgNST1突变体菌株分别接种在含NaCl(0㊁1.0mol㊃L-1)的CM 液体培养基中,28ħ培养7d,提取RNA,反转录成cDNA,利用实时定量PCR分析FgMGV1基因的相对表达量,FgMGV1基因的扩增引物见表2,荧光定量PCR方法见参考文献[22]㊂试验重复3次,每个模板设置3个重复,Tublin做内参,根据反应的CT值,用2-әәCT法进行基因相对表达量的分析㊂1.2.8㊀数据分析方法㊀利用SPSS Statistics17软件进行试验数据的统计分析,采用方差分析进行变量的差异显著性检验,曲线图中不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05)㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀禾谷镰刀菌FgNST1与FgMGV1的序列分析
根据酿酒酵母菌NST1和SLT2基因对应的氨基酸序列在NCBI数据库中进行比对发现,禾谷镰刀菌含有NST1保守域基因为FGSG_04069,本研究命名为FgNST1基因,DNA全长为3742bp,蛋白质编码区(coding sequence,CDS)为3579bp,编码1192个氨基酸㊂对FGSG_04069编码的蛋白进行保守域分析[23],如图1所示㊂该蛋白含有NST1㊁TolA和Atrophi-1共3个保守域,其中NST1保守域位于该蛋白的139~273个氨基酸位置,为
第6期薛晓雯,等:禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及DON毒素合成的影响989
㊀
盐耐受负调控因子㊂对FgNST1同源蛋白进行系统发育分析,如图2所示㊂禾谷镰刀菌FgNST1与黄色镰刀菌Fusarium culmorum的胁迫反应蛋白相似度最高,与多种镰刀菌属的NST1蛋白聚在1个相同分支;曲霉菌属Aspergillus的NST1蛋白聚在1个相同分支;酵母菌属的NST1蛋白聚在遗传距离较远的另外分支㊂这表明,该蛋白在各类真菌中具有极高的保守性,与盐胁迫反应相关
㊂
图1㊀禾谷镰刀菌FgNST1蛋白的保守域结构预测
Fig.1㊀Prediction of conserved domain structure of
FgNST1
注:标尺表示遗传进化距离,黑色圆圈表示禾谷镰刀菌FgNST1序列,
括号中的内容代表蛋白序列ID号㊂
Note:The bar shows the evolutionary distance.The black circle indicates the FgNST1sequence.
The content in the brackets represent the protein sequence ID numbers.
图2㊀禾谷镰刀菌和其它部分真菌NST1蛋白的系统发育分析
Fig.2㊀Phylogenetic analysis of NST1protein in Fusarium graminearum and other partial fungi
㊀㊀禾谷镰刀菌MGV1基因(FGSG_10313)全长为
1810bp,编码序列CDS为1251bp,编码416个氨基
酸,编码产物为MAPK spm1,本研究将MGV1基因命
名为FgMGV1㊂对FgMGV1蛋白进行保守域分析,结
果如图3所示㊂FgMGV1蛋白含有丝氨酸/苏氨酸蛋
白激酶催化中心(Serine/Threonine protein kinase cat-
alytic center,STKc)保守域,STK是细胞响应外界信
号的重要介质,是与细胞壁完整性途径相关的
MAPK,推测对响应胁迫有重要作用㊂
2.2㊀盐胁迫下禾谷镰刀菌FgNST1与FgMGV1
基因的表达
以不添加NaCl和添加1.0mol㊃L-1NaCl的
CM液体培养基中培养7d的禾谷镰刀菌野生型菌
株cDNA为模板,采用荧光定量PCR技术分析
FgNST1和FgMGV1基因相对表达情况,结果如图
4所示㊂与不加NaCl相比,FgNST1基因在NaCl
处理后的野生型菌株中的相对表达量表现为显著
下调响应,是对照的0.4倍;FgMGV1基因在NaCl
胁迫的野生型菌株中的表达显著上调,为对照的
1.4倍㊂这表明FgNST1和FgMGV1基因参与了禾
谷镰刀菌盐胁迫的应答反应,FgNST1是盐胁迫负
调控因子㊂
990㊀河㊀南㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第54
卷
图3㊀禾谷镰刀菌FgMGV1保守域预测Fig.3㊀Prediction of conserved domain of
FgMGV1
注:同组间不同字母表示差异显著(P <0.05)㊂下同㊂Note:Different letters mean significant differences (P <0.05)
in the same groups.The same as below.
图4㊀FgNST1与FgMGV1基因在
NaCl 胁迫下的相对表达量
Fig.4㊀Relative expression levels of FgNST1
and FgMGV1genes under NaCl stress
2.3㊀重组载体的构建
为证明FgNST1与FgMGV1的相互作用关系,本研究首先构建重组载体㊂FgNST1编码蛋白的NST1保守域位于第139~273个氨基酸处,对
FgNST1cDNA 的1~819bp 长度的片段进行扩增㊂以PH-1的cDNA 为模板,用引物WFNST1F /
WFNST1R 扩增到FgNST1保守域片段,大小为819bp,如图5-A 所示;用引物WFHMGV1F /WFH-MGV1R 扩增FgMGV1片段,大小为1251bp,如图
5-B 所示㊂将质粒载体pGBKT7和pGADT7分别
通过双酶切进行线性化,纯化回收的质粒pGBKT7与FgMGV1片段重组连接,pGADT7与FgNST1保守域片段重组连接,重组转化子通过酶切验证,分别得到质粒片段和目的条带,如图6所示㊂将重组转化子菌液进行测序,插入的FgMGV1片段㊁FgNST1保守域片段与数据库中核苷酸序列完全
一致,表明重组载体pGBKT7-FgMGV1㊁pGADT7-FgNST1构建成功
㊂
注:M,Marker QDL2000;1,FgNST1保守域片段(A)或FgMGV1片段(B)㊂
Note:M,Marker QDL2000;1,FgNST1conserved domain fragment (A)or FgMGV1fragment (B).
图5㊀FgNST1与FgMGV1片段的扩增
Fig.5㊀Amplification of FgNST1and FgMGV1fragment
2.4㊀重组质粒的毒性及自激活检测分析
重组质粒pGADT7-FgNST1㊁pGBKT7-FgMGV1分别转化酵母菌AH109后,转化子分别在SD /-Leu 液体培养基㊁SD /-Trp 液体培养基中生长1d 后测
定的OD 600均大于0.8,说明重组质粒对酵母细胞
无毒性㊂含有重组质粒pGADT7-FgNST1㊁pG-
BKT7-FgMGV1的转化子自激活检测结果如图7所
示㊂pGADT7-FgNST1在SD /-Leu /-Ade 和SD /-Leu /-His 培养基上不能生长,在SD /-Leu /X-α-Gal 培养基上可以生长,但不变蓝;pGBKT7-FgMGV 1在SD /-Trp /-Ade㊁SD /-Trp /-His 培养基上不能生长,在SD /-Trp /X-α-Gal 培养基上可以生长,但不
第6期薛晓雯,等:禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及DON毒素合成的影响991
㊀
变蓝色㊂检测结果表明,FgNST1和FgMGV1蛋白
均不能自激活载体上的ADE2㊁HIS3和MEL1报告
基因,可以进行下一步酵母双杂交验证
㊂
注:M,Marker P;1,酶切前的质粒pGADT7-NST1(A)或pGBKT7-FgMGV1(B);
2,酶切后的质粒pGADT7-NST1(A)或pGBKT7-FgMGV1(B)㊂
Note:M,Marker P;1,Plasmid pGADT7-FgNST1(A)or pGBKT7-FgMGV1(B)before enzyme digestion;
2,Plasmid pGADT7-FgNST1(A)or pGBKT7-FgMGV1(B)after enzyme digestion.
图6㊀融合质粒pGADT7-FgNST1(A)与诱饵质粒pGBKT7-FgMGV1(B)的载体构建
Fig.6㊀Constructions of the vector of fusion plasmid pGADT7-FgNST1(A)and bait plasmid pGBKT7-FgMGV1(B
)
注:1,pGADT7-RecT+pGBKT7-P53转化子(阳性对照);2,pGADT7-FgNST1(A)
或者pGBKT7-FgMGV1(B)转化子;3,pGADT7转化子(A)或者pGBKT7转化子(B)(阴性对照)㊂Note:1,pGADT7-RecT+pGBKT7-P53transformant(positive control);2,pGADT7-FgNST1(A)or pGBKT7-FgMGV1(B)transformant;
3,pGADT7(A)or pGBKT7(B)transformant(negative control).
图7㊀重组质粒pGADT7-FgNST1(A)和重组质粒pGBKT7-FgMGV1(B)的自激活检测Fig.7㊀The autoactivation detection of recombinant plasmids pGADT7-FgNST1and pGBKT7-FgMGV1
2.5㊀禾谷镰刀菌FgNST1与FgMGV1的相互作用分析
将重组质粒pGADT7-FgNST1与pGBKT7-Fg-MGV1共转到酵母菌AH109中,转化子经质粒PCR验证显示,可以扩增出819bp的FgNST1片段和1251bp的FgMGV1片段,证明共转成功,如图8所示㊂pGADT7-FgNST1+pGBKT7-FgMGV1转化子菌液在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal固体培养基上划线培养,结果如图9所示,pGADT7-FgNST1+pGBKT7-FgMGV1共转转化子可以生长,且菌落颜色呈现蓝色,表明禾谷镰刀菌FgNST1与FgMGV1蛋白相互作用,激活了ADE2㊁HIS3和MEL1报告基因的表达
㊂注:M,Marker S plus;1,FgMGV1片段;2,FgNST1片段㊂Note:M,Marker S plus;1,The FgMGV1fragment;
2,The FgNST1fragment.
图8㊀pGADT7-FgNST1和pGBKT7-FgMGV1
共转转化子验证
Fig.8㊀Verification of cotransformation of
pGADT7-FgNST1and pGBKT7-FgMGV1
992
㊀河㊀南㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第54
卷
注:1,pGADT7-RecT+pGBKT7-P53(阳性对照);2,pGADT7-RecT+ pGBKT7-Lam(阴性对照);3,pGADT7+pGBKT7(阴性对照);4, pGADT7-FgNST1+pGBKT7(阴性对照);5,pGADT7+pGBKT7-FgMGV1(阴性对照);6,pGADT7-FgNST1+pGBKT7-FgMGV1㊂Note:1,pGADT7-RecT+pGBKT7-P53(positive control);2, pGADT7-RecT+pGBKT7-Lam(negative control);3,pGADT7+pG-BKT7(negative control);4,pGADT7-FgNST1+pGBKT7(negative control);5,pGADT7+pGBKT7-FgMGV1(negative control);
6,pGADT7-FgNST1+pGBKT7-FgMGV1.
图9㊀酵母双杂交技术验证FgNST1和FgMGV1
的相互作用
Fig.9㊀Confirmation of interaction between FgNST1 and FgMGV1by yeast two-hybrid technique
为进一步探讨FgNST1与FgMGV1功能之间的相关性,本研究分析了FgMGV1基因在野生型和әFgNST1突变体菌株中的表达,结果如图10所示㊂在无NaCl胁迫时,FgMGV1在野生型中有表达,但是在әFgNST1中几乎不表达,这可能与FgNST1和FgMGV1之间存在相互作用有关;在有NaCl胁迫时,FgMGV1在野生型中的表达显著上调,是无NaCl胁迫时的1.4倍,且在әFgNST1突变体中的相对表达显著高于野生型,表明NaCl的高渗透胁迫信号激活了MAPK途径中的CWI途径,使CWI途径中的FgMGV1基因的表达量上调,从而抑制了因FgNST1缺失造成的对细胞的影响㊂因此,在外界存在盐胁迫时,FgNST1与FgMGV1在功能上具有相关性㊂
2.6㊀禾谷镰刀菌FgNST1对DON毒素合成的影响
生物在受到外界环境胁迫时通常会通过调节代谢以适应特异的环境,一些产毒真菌会通过调节次级代谢如真菌毒素作为适应环境胁迫条件的生态进化[24]㊂本研究将野生型菌株PH-1和әF-gNST1突变体菌株接种到小麦基质培养基中进行产毒培养,DON毒素检测结果如图11所示㊂在无NaCl的小麦基质培养基中,әFgNST1突变体菌株在7d时产生的DON毒素显著高于野生型菌株,而在随后的时期均显著低于野生型菌株,14d时产生的DON毒素减少幅度达到野生型毒素产生量的50%;在加NaCl的小麦基质中,野生型和әF-gNST1突变体菌株合成的DON毒素均比无NaCl 的小麦基质中显著减少,在同一生长时期,әF-gNST1突变体产生的DON毒素均比野生型稍高,但是2种菌株产生的DON毒素在培养开始前21d 增加并不显著
㊂
图10㊀FgMGV1基因在野生型和
әFgNST1突变体中的相对表达量
Fig.10㊀Relative expression level of FgMGV1
in wild type andәFgNST1knock-out
mutant
图11㊀不同生长时期的野生型和әFgNST1
突变体菌株在小麦基质中产生的DON毒素Fig.11㊀The DON toxin synthesis of wild type and
әFgNST1mutant strains in wheat matrix
medium at different growth stages
3㊀结论与讨论
本研究对禾谷镰刀菌FgNST1蛋白进行保守域分析,显示该蛋白含有盐耐受负调控因子NST1保守域;对FgNST1及其同源蛋白进行系统发育分析,显示FgNST1与多种镰刀菌属聚在相同分支,曲霉菌属的NST1蛋白都聚在另外相同分支,表明该蛋白在各属中具有极高的保守性和相似的生物学功能㊂由于在酵母菌研究中发现NST1与剪切
第6期薛晓雯,等:禾谷镰刀菌FgNST1对FgMGV1及DON毒素合成的影响993
㊀
因子Msl1p相互作用影响盐的耐受性,直接或间接参与对盐的敏感性反应[18],推测FgNST1基因也可能在禾谷镰刀菌对盐胁迫的适应性中具有调控作用㊂本研究分析显示禾谷镰刀菌FgMGV1基因编码的产物为MAPK spm1,FgMGV1蛋白含有STKc保守域㊂STK是细胞响应热胁迫㊁渗透胁迫和氧化胁迫等外界信号的重要介质,对维持细胞形态㊁细胞壁建成和离子稳态产生重要影响[25],推测FgMGV1在对盐胁迫响应中具有重要作用㊂通过分析FgNST1和FgMGV1基因对盐胁迫的响应,表明在盐胁迫下FgNST1基因表达显著下调,FgMGV1基因表达则显著上调㊂通过酵母双杂交试验显示,禾谷镰刀菌FgNST1与FgMGV1可以相互作用㊂LENG等[19]研究了酵母菌NST1的生物学功能,指出NST1可以与HOG信号途径中的Ste11相互作用,也可以与CWI途径中的Mkk1相互作用,从而使不同信号途径之间交互作用㊂在盐胁迫下,许多产毒真菌如黄曲霉属㊁青霉属和镰刀菌属等微生物通过MAPK㊁钙调信号等途径调控次级代谢产物的合成而维持自身生长[26]㊂HOU 等[16]在研究禾谷镰刀菌MAP激酶MGV1时发现, mgv1缺失突变体在接种的小麦中积累的DON毒素显著降低,表明MGV1影响DON毒素的合成㊂MACHELEIDT等[12]对真菌次级代谢调控研究发现,在外界环境胁迫下,真核生物可通过信号级联反应将信号传导给细胞内的各类调控因子,以调控基因的表达和次级代谢物的合成,从而适应环境的变化维持自身生长㊂本研究结果表明,FgNST1对DON毒素合成有显著影响,并且FgNST1与Fg-MGV1具有相互作用的特性㊂在盐胁迫下,FgNST1可能通过MAPK途径中的FgMGV1调控DON毒素合成㊂
盐胁迫调控次生代谢产物合成具有不同的特点㊂本研究中禾谷镰刀菌在盐胁迫下引起DON毒素合成显著减少;在北欧青霉(Penicillium nordi-cum)中,NaCl质量浓度的增加反而诱导了赭曲霉毒素的合成[27];在烟曲霉中NaCl质量浓度增高到70g㊃L-1时分泌胶霉毒素的能力达到最大[28]㊂这些研究表明,真菌毒素的合成与环境变化密切相关,环境胁迫相关基因具有间接调控的作用㊂探讨禾谷镰刀菌毒素调控基因的相互作用,对逆境条件下防控禾谷镰刀菌及其DON毒素污染具有潜在的应用价值,对保障食品安全具有重要的意义㊂
参考文献:
[1]㊀STARKEY D E,WARD T J,AOKI T,et al.Global mo-
lecular surveillance reveals novel Fusarium head blight
species and trichothecene toxin diversity[J].Fungal Ge-
netics&Biology,2007,44(11):1191-1204. [2]㊀SELVARAJ J N,ZHAO Y,SANGARE L,et al.Limit-
ed survey of deoxynivalenol in wheat from different crop
rotation fields in Yangtze-Huaihe river basin region of
China[J].Food Control,2015,53:151-155. [3]㊀MOREIRA G M,NICOLLI C P,GOMES L B,et al.
Nationwide survey reveals high diversity of Fusarium
species and related mycotoxins in Brazilian rice:2014
and2015harvests[J].Food Control,2020,
113:107171.
[4]㊀RAMIREZ M L,CHULZE S,MAGAN N.Temperature
and water activity effects on growth and temporal de-
oxynivalenol production by two Argentinean strains of
Fusarium graminearum on irradiated wheat grain[J].
International Journal of Food Microbiology,2006,106
(3):291-296.
[5]㊀FENG J,AKIRA K,TAKASHI N.Effects of different
carbon sources on trichothecene production and Tri gene
expression by Fusarium graminearum in liquid culture
[J].Fems Microbiology Letters,2008,285(2):212-
219.
[6]㊀MERHEJ J,RICHARD-FORGET F,BARREAU C.
The pH regulatory factor Pac1regulates Tri gene expres-
sion and trichothecene production in Fusarium gra-
minearum[J].Fungal Genetics and Biology,2011,48
(3):275-284.
[7]㊀KYUNGHUN M,YUNGIN S,HOKYOUNG S,et al.
Functional analyses of the nitrogen regulatory gene areA
in Gibberella zeae[J].Fems Microbiology Letters,
2012,334(1):66-73.
[8]㊀PONTS N,PINSON-GADAIS L,BARREAU C,et al.Ex-
ogenous H2O2and catalase treatments interfere with Tri
genes expression in liquid cultures of Fusarium graminea-
rum[J].Febs Letters,2007,581(3):443-447. [9]㊀HU S,ZHOU X Y,GU X Y,et al.The cAMP-PKA
pathway regulates growth,sexual and asexual differenti-
ation,and pathogenesis in Fusarium graminearum[J].
Molecular Plant-Microbe Interactions,2014,27(6):
557-566.
[10]YIN Y N,UN Y Z,XU J R,et al.The TOR signaling
pathway regulates vegetative development and virulence
in Fusarium graminearum[J].New Phytologist,2014,
203(1):219-232.
[11]JENCZMIONKA N J,MAIER F J,ANKE P L,et al.
Mating,conidiation and pathogenicity of Fusarium gra-
minearum,the main causal agent of the head-blight dis-
ease of wheat,are regulated by the MAP kinase gpmk1
994
㊀河㊀南㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第54卷
[J].Current Genetics,2003,43(2):87-95. [12]MACHELEIDT J,MATTERN D J,FISCHER J,et al.
Regulation and role of fungal secondary metabolites[J].
Annual Review of Genetics,2016,50(1):371-392. [13]WU P H,HO Y L,HO T S,et al.Microbial volatile
compounds-induced cytotoxicity in the yeast Saccharo-
myces cerevisiae:The role of MAPK signaling and pro-
teasome regulatory pathway[J].Chemosphere,2019,
233:786-795.
[14]WANG C F,ZHANG S J,HOU R,et al.Functional anal-
ysis of the kinome of the wheat scab Fungus Fusarium gra-
minearum[J].Plos Pathogens,2011,7(12):e1002460.
[15]REN J,LI C,GAO C,et al.Deletion of FgHOG1is
suppressive to the mgv1mutant by stimulating Gpmk1
activation and avoiding intracellular turgor elevation in
Fusarium graminearum[J].Frontiers in Microbiology,
2019,10:1073.
[16]HOU Z,XUE C,PENG Y,et al.A mitogen-activated
protein kinase gene(MGV1)in Fusarium graminearum
is required for female fertility,heterokaryon formation,
and plant infection[J].Molecular plant-microbe inter-
actions:MPMI,2002,15(11):1119-1127. [17]MANUEL RODRIGUEZ-PENA J,ARROYO J,NOM-
BELA C,et al.The high-osmolarity glycerol(HOG)
and cell wall integrity(CWI)signalling pathways inter-
play:a yeast dialogue between MAPK routes[J].
Yeast,2010,27(8):495-502.
[18]GOOSSENS A J,FORMENT J,SERRANO R.Involve-
ment of Nst1p/YNL091w and Msl1p,a U2Bᵡsplicing
factor,in Saccharomyces cerevisiae salt tolerance[J].
Yeast,2002,19(3):193-202.
[19]LENG G,SONG K.Direct interaction of Ste11and
Mkk1/2through Nst1integrates high-osmolarity glycerol
and pheromone pathways to the cell wall integrity MAPK
pathway[J].Febs Letters,2016,590(1):148-160.
[20]朱丽红.小麦赤霉病菌Rab互作溶酶体蛋白对DON
毒素生物合成的影响[D].郑州:河南工业大
学,2019.
[21]杨友伟,欧雪洁,杜婷,等.小麦-黑麦-偃麦草三属杂
种后代细胞遗传学及赤霉病抗性鉴定[J].河南农业
大学学报,2018,52(4):492-496.
[22]孟瑶,翟焕趁,张帅兵,等.小麦赤霉病菌FgVPS26
与FgRab7的相互作用及对DON毒素合成的影响
[J].河南工业大学学报(自然科学版),2019,40
(2):20-26.
[23]MARCHLER-BAUER A,BO Y,HAN L Y,et al.
CDD/SPARCLE:functional classification of proteins via
subfamily domain architectures[J].Nucleic Acids Re-
search,2017,45(D1):D200-D203. [24]MEDINA A,SCHMIDT-HEYDT M,RODRÍGUEZ A,
et al.Impacts of environmental stress on growth,sec-
ondary metabolite biosynthetic gene clusters and metabo-
lite production of xerotolerant/xerophilic fungi[J].Cur-
rent Genetics,2015,61(3):325-334. [25]MADRID M,NUNEZ A,SOTO T,et al.Stress-activa-
ted protein kinase-mediated down-regulation of the cell
integrity pathway mitogen-activated protein kinase Pmklp
by protein Phosphatases[J].Molecular Biology of the
Cell,2007,18(11):4405-4419.
[26]WANG S,ZHOU H,WU J,et al.Transcriptomic
analysis reveals genes mediating salt tolerance through
calcineurin/CchA-independent signaling in Aspergillus
nidulans[J].Biomed Research International,2017,
2017:4378627.
[27]RODRÍGUEZ A,MEDINA A,C RDOBA J J,et al,
The influence of salt(NaCl)on ochratoxin A biosyn-
thetic genes,growth and ochratoxin A production by
three strains of Penicillium nordicum on a dry-cured
ham-based medium[J].International Journal of Food
Microbiology,2014,178:113-119.
[28]彭海燕,赵瑞,李谦,等.盐胁迫对胶霉毒素生物合
成基因gliT表达的影响[J].中国药科大学学报,
2011,42(6):555-559.
(责任编辑:曾庆东)。