高效液相色谱法同时测定瑶药四方藤中四种活性成分的含量

高效液相色谱法同时测定瑶药四方藤中四种活性成分的含量汪艳平;张晖英;韦正;蓝建京;宁东元;韦晖谋
【摘要】目的:建立HPLC同时测定四方藤中没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇的含量测定方法.方法:采用Grace Allitima C18色谱柱(250 mm﹡4.6 mm,5μm),流动相乙腈-0.5%醋酸水,流速0.8 mL·min-1,柱温35°C,梯度洗脱.结果:HPLC定量结果为没食子酸的线性范围2.10~280.00μg·mL-1,平均回收率100.72%,岩白菜素的线性范围10.80~1443.20μg·mL-1,平均回收率
100.70%,11-O-没食子酰岩白菜素的线性范围5.90~780.00μg·mL-1,平均回收率101.11%,白藜芦醇的线性范围1.50~200.00μg·mL-1,平均回收率101.92%.结论:HPLC含量测定方法简便,结果准确,重复性好,可作为四方藤的质量控制方法.【期刊名称】《河池学院学报》
【年(卷),期】2018(038)002
【总页数】7页(P14-20)
【关键词】没食子酸;岩白菜素;11-O-没食子酰岩白菜素;白藜芦醇;HPLC
【作者】汪艳平;张晖英;韦正;蓝建京;宁东元;韦晖谋
【作者单位】河池学院化学与生物工程学院;红水河流域药用资源综合开发利用重点实验室,广西河池 546300;河池学院化学与生物工程学院;红水河流域药用资源综合开发利用重点实验室,广西河池 546300;河池学院化学与生物工程学院;红水河流域药用资源综合开发利用重点实验室,广西河池 546300;河池学院化学与生物工程学院;河池学院化学与生物工程学院;河池学院化学与生物工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
0 引言
四方藤(Cissus pteroclada Hayata)又名方藤、红四方藤。

主要生长于台湾、广东、海南、广西、云南等地，生于山谷丛林[1]90。

据《广西中药志》记载，四方藤茎
可入药，其味微苦，涩，甘，性平。

具有舒筋活络，去癖生新，治跌打损伤，筋络拘挛的功效[2]138。

四方藤是瑶族常用草药，民间用于治疗风湿痹痛等疾病
[3]668。

四方藤(瑶药名“四方钻”)是“十八钻之一”，是常用的经典老班药，瑶医认为其属于风药，具有祛风除湿，祛风散邪，穿经走脉，舒经活络，去瘀生新之功效[4]。

具有较好的开发利用价值。

四方藤主要化学成分为甾体类、有机酸类和
异香豆素类化合物[5]。

潘玉光等[6]从四方藤的乙酸乙酯部位中分离得到了5个甾体和2个三萜类化合物，分别鉴定为：豆甾醇、豆甾醇乙酸酯、△5.22 -豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、β-谷甾醇、β-胡萝卜苷、蒲公英赛酮、齐墩果酸。

潘保强等[7]从四方藤中分离出来异香豆素和岩白菜素。

池翠云等[8]经过试验，从中分离得到
9个单体化合物和1个混合物，鉴定为：β-香树脂醇、白桦脂酸、β-谷甾醇、木栓酮、11-O-没食子酰岩白菜素、11-0-(4-羟基苯甲酰基)岩白菜素、胡萝卜苷、没
食子酸、岩白菜素、β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的混合物。

本课题组前期通过
液质联用方法对四方藤的化学成分进行研究，鉴定出没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇等化合物，并通过网络药理学方法预测四方藤临床治疗风湿、类风湿性关节炎的主要化学物质基础为没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素等[9]。

目前有文献[10-12]建立了四方藤药材中三种岩白菜素类化合物的HPLC 含量测定方法以及岩白菜素和白藜芦醇的HPLC 含量测定方法，但未
见有同时测定不同产地、不同批次四方藤中没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇含量的研究报道。

为了合理利用四方藤药用植物资源，促进少数民族药物的开发利用，本文采用高效液相色谱法对四方藤中没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇进行含量测定，并对26个不同批次的四方藤
中4种成分进行了含量比较分析，旨在为四方藤的质量控制研究提供参考，并对
四方藤药材的进一步开发利用提供一定的测试手段和理论依据。

1 仪器与材料
1.1 试验仪器
Agilent1200 series 高效液相色谱仪(包括低压二元梯度泵G1312A，柱温箱
G1316A，二极管阵列检测器G1315B，Chemstation化学工作站，美国Agilent 科技有限公司)，CS-700药材粉碎机(武义海纳电器有限公司)，Milli-Q Synthesis 超纯水纯化系统(Millipore公司)，RQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司)，FA1004B(电子天平上海越平科学仪器有限公司)，0.22 μm有机微孔滤
头(津腾公司)。

1.2 试验试剂
乙腈(色谱纯，美国Fisher scientific公司)；其它试剂为分析纯；甲醇(分析纯，北京化工厂)，乙酸(北京东方精细化工品有限公司)；超纯水(MilliQ超纯水，过0.45 μm微孔滤膜)。

岩白菜素(成都普菲德生物技术有限公司，批号16071410，纯度98%以上)，没食子酸(成都普菲德生物技术有限公司，批号151009，纯度98%以上)，白藜芦醇(成都普非德生物技术有限公司，批号160317，纯度98%以上)，
11-O-没食子酰岩白菜素(南京森贝伽生物科技有限公司，批号S1*******，纯度98%以上)。

1.3 试验药材
药材四方藤购自不同药店，样品购买和采摘时间为2015年8月至2016年4月之
间，样品药材信息见表1，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为葡萄科植物戟叶白粉藤属四方藤的根茎。

表1 26批四方藤的样品信息
编号生产批号来源编号生产批号来源S1150301广西南宁市S1*******广西河池市S2131001广西贵港市S1520151230广西河池市S3131030广西贵港市
S1*******广西河池市S4*******安徽毫州市S1*******广西柳州市
S5150910广西河池市S1*******广西柳州市S6151019广西河池市
S191407001广东梅州市S7150920广西河池市S2*******广东梅州市
S8141110云南海口市S211406030广西岑溪市S9150405广西柳州市
S221507010广西贵港市S1*******广西河池市S2*******广西玉林市
S1*******广西河池市S241405060广西贵港市S1*******广西河池市
S2*******广西柳州市S1*******广西河池市S2620140625广西柳州市
2 方法与结果
2.1 色谱及检测条件
Grace Allitima C18色谱柱(250 mm * 4.6 mm，5 μm)；流动相采用二元梯度洗脱系统，A相：0.5%醋酸-水，B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～30 min，4%～25%B；30～35 min，25%～35% B；35～50 min，35%～95%；检测波长为：276 nm(没食子酸，岩白菜素，11-O-没食子酰岩白菜素)，306 nm(白藜芦醇)；柱温35 °C；流速0.8 mL·min-1，进样量10 μL。

对照品和四方藤供试液的HPLC色谱图见图1。

注：图中(A)为混合对照品276 nm下HPLC-DAD图谱，(B)四方藤供试品276 nm下HPLC-DAD图谱，(C)四方藤供试品306 nm波长下HPLC-DAD图谱；1为没食子酸，2为岩白菜素，3为11-O-没食子酰岩白菜素，4为白藜芦醇。

图1 HPLC-DAD图谱
2.2 标准溶液的制备
分别精密称取没食子酸7.00 mg、岩白菜素36.08 mg、白藜芦醇5.00 mg，加75%甲醇分别定容至5 mL容量瓶中，精密称取11-O-没食子酰岩白菜素7.80 mg，加75 %甲醇定容至2 mL容量瓶中，超声20 min，摇匀，作为对照品储备溶液，置于-4 °C冰箱中待用。

2.3 四方藤供试液的制备
精密称取经粉碎过4号筛四方藤样品粉末0.2 g，置于10mL容量瓶中，加入75%甲醇约10 mL，超声30 min，超声1次，静止后补充75%甲醇至刻度，摇匀，
待用。

2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系的考察
精密吸取没食子酸储备液1 mL，岩白菜素储备液1 mL，11-O-没食子酰岩白菜
素1 mL，白藜芦醇储备液1 mL转移至5 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，标记1。

精密吸取2.5 ml标记1转移至5 mL容量瓶中，加75 %甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，标记2。

精密吸取2.5 mL标记2转移至5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，标记3。

精密吸取2.5mL标记3转移至5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，标记4。

精密吸取3 mL标记4转移至5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，标记5。

精密吸取2.5 mL标记5转移至5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至5 mL容量瓶中，摇匀，标记6。

精密吸取1 mL标记5转移至10 mL容量瓶中，加75%甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，标记7共计7个浓度点。

以上各对照品溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件平行测定2次，以各对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

以信噪比为3∶1时相应
浓度确定其检测限，以信噪比为10∶1时相应浓度确定其定量限。

表2 四方藤中四种成分线性考察结果
化合物标准曲线R2线性范围/(μg·mL-1)检测限/μg定量限/μg没食子酸y =
17.600 x - 27.2130.999 92.10～280.000.050.10岩白菜素y = 17.217 x +
32.9001.000 010.80～1 443.200.020.4011-O-没食子酰岩白菜素y = 23.692 x + 27.0710.999 75.90～780.000.030.60白藜芦醇y = 47.215 x - 26.6380.999 91.50～200.000.020.30
2.4.2 精密度实验
精密称取四方藤样品0.2 g，制备成供试品溶液连续进样6次，测定各成分的含量(mg·g-1)，没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇的RSD分
别为0.923%，0.043 %，0.175%，0.911%，表明仪器精密度良好(n=6)。

2.4.3 重复性实验
精密称取四方藤样品6份，每份0.2 g，制备成供试品溶液进样，测定各成分的含量(mg· g-1)，没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇的RSD 分别为1.423%，0.598%，2.604%，4.590%，表明建立的方法重复性良好。

2.4.4 稳定性实验
精密称取四方藤样品0.2 g，制备成供试品溶液分别在0，2，4，8，16，24 h进样，测定各成分的含量(mg·g-1)，没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇的RSD分别为2.610%，0.501%，0.515%，0.944%，表明四方藤样品供试液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收实验
取已知含量的四方藤样品粉末9份，各0.1 g，精密称定，按照供试品制备方法制备，每三份一组，分别加入已知供试品含量的(80%，100%，120%)三个浓度的
对照品，对照品是没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇。

按
照已定的色谱条件进样10 μL，平行测定三次，计算其回收率。

表3 四种成分的加样回收试验
化合物名称样品含量/μg加入量/μg测得总量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%没食子酸
77.3596.48172.3498.4677.3580.40159.60102.3077.3564.32142.58101.41100. 721.63
表3(续)岩白菜素1 280.201 512.002 834.20102.781 280.201 260.002
580.40103.191 280.201 008.002 249.2096.13100.703.9311-O-没食子酰岩白菜素
422.40540.72957.5098.96422.40450.60892.80104.39422.40360.48782.8499. 99101.112.85白藜芦醇
11.1014.6426.42104.6411.1012.2023.81104.1811.109.7620.5696.93101.924.
26
由表3可知，四方藤中各成分的加样回收率均在95%～105%之间，RSD值均小于5%，表明该方法准确性良好。

2.5 四方藤药材的含量测定
按照“2.3”项下方法制备供试液样品，按照“2.1”项下液相色谱条件测定样品，共计26份样品，结果如下：
表4 四方藤样品中4种成分的含量测定
编号生产批号来源没食子酸/(mg·g-1)岩白菜素/(mg·g-1)11-O-没食子酰岩白菜素/(mg·g-1)白藜芦醇/(mg·g-1)S1150301广西南宁市
1.6518.994.520.48S2131001广西贵港市1.5927.4410.690.11S3131030广西贵港市1.4324.9410.740.08S41506001安徽毫州市1.4820.155.710.28S5150910广西河池市1.6121.204.710.43S6151019广西河池市
0.7426.338.110.63S7150920广西河池市1.5613.335.440.10S8141110云南海口市1.1127.7510.600.25S9150405广西柳州市0.097.03-0.04S10151005广西河池市2.1029.5110.180.14S11151217广西河池市
1.5731.746.460.15S12160301广西河池市1.7821.744.840.39S13150427广西河池市1.3423.363.320.22S14150601广西河池市
1.6727.716.090.12S1520151230广西河池市
2.1924.4311.200.07S16140601广西河池市1.5626.392.230.24S17160301广西柳州市
1.2734.197.930.15S18160402广西柳州市1.6430.816.960.27S191407001广东梅州市1.1318.313.280.36S20150304广东梅州市1.1517.303.160.28
表4(续)S211406030广西岑溪市1.1923.566.440.20S221507010广西贵港市0.9427.0610.340.17S23150201广西玉林市1.6220.373.600.14S241405060广西贵港市1.6614.914.140.36S25060169广西柳州市
2.2518.770.680.17S2620140625广西柳州市1.7328.631.500.37平均含量
1.462
2.976.110.24
注：表中“-”表示未检出。

3 讨论
3.1 含量测定结果分析
本文成功建立了同时测定瑶药四方藤中4种化学成分含量的HPLC方法。

该方法简单、快速、准确可靠，为提高四方藤的质量控制水平奠定了基础。

26批四方藤中没食子酸的平均含量为1.46 mg·g-1，岩白菜素的平均含量为22.97 mg·g-1，11-O-没食子酰岩白菜素的平均含量为6.11 mg·g-1，白藜芦醇的平均含量为0.24 mg·g-1。

其中没食子酸含量最高的为S10，岩白菜素含量最高的为S11，11-O-没食子酰岩白菜素含量最高的是S15，白藜芦醇含量最高的是S6，以上四个批次的药材均产自广西河池市，该产区的四方藤药材拥有较高的品质，该地区也
是瑶药四方藤民间应用较多的地区。

3.2 HPLC色谱条件的优化
本文考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.1%甲酸水甲醇-0.1%磷酸水，0.5%醋酸水-乙腈之后，根据考察的结果发现，最终以0.5%醋酸水-乙腈流动相分离效果最佳。

此外，还对不同色谱柱(Grace Allitima
C18色谱柱，Agilent C18色谱柱，Stamsil-Bp C18色谱柱)，不同检测波长(230，254，270，280，306 nm)，不同柱温(25，30，35，40°C)和不同的洗脱梯度进行了考察，根据 4 种成分的分离度、峰型、对称因子确定了最佳的HPLC色谱条件。

3.3 样品提取条件的优化
在供试品溶液制备时，分别考察了不同提取方法(超声、冷浸、回流)、不同提取溶媒(水，甲醇，乙醇)，不同料液比(1∶25，1∶50，1∶100)，不同提取时间(20，30，40，50 min)，提取次数(1次，2次，3次)，最终确定了最佳的供试品溶液
制备方法。

4 结论
本研究建立了同时测定四方藤中没食子酸、岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、白藜芦醇含量的HPLC方法，该方法快速、准确、可靠、重复性好。

采用该方法对收集的26批四方藤进行含量测定，结果表明四方藤药材中四种成分的含量由高到低依次为岩白菜素、11-O-没食子酰岩白菜素、没食子酸、白藜芦醇，其中岩白菜素为其最主要的化学成分。

26批四方藤药材中广西河池市产的四方藤主要化学
成分含量较高，广西河池市为瑶药四方藤民间应用较多的地区和道地产区。

参考文献：
[1]广西壮族自治区食品监督管理局.壮药质量标准：第2卷[M].南宁：广西科学技
术出版社，2011.
[2]广西壮族自治区卫生厅.广西中药志：第2辑[M].南宁：广西人民出版社，1963.
[3]广西卫生局.广西本草选编[M].南宁：广西人民出版社，1974．
[4]罗远，叶雲，赵晓芳，等.瑶药四方藤提取物对类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织
的影响[J].中药材，2013，36(12)：2000-2003.
[5]蒋兰兰，甄汉深，周颖.四方藤研究概况[J].亚太传统医药，2015(6)：65-67.
[6]潘光玉，李雯霏，罗培，等.四方藤中甾体及三萜类成分研究[J].中药材，2013，36(8)：1274-1277．
[7]潘保强.濮全龙.四方藤化学成分研究简报[J].中草药.1981.12(6)：45.
[8]池翠云，王锋，雷婷，等.瑶药四方藤化学成分研究[J].中药材，2010，10：1566-1568.
[9]汪艳平，潘立卫，韦正，等.基于网络药理学方法探讨瑶药四方藤抗类风湿性关
节炎的作用机制[J].大众科技，2017，19(212)：68-70.
[10]陈如意，罗培，李怡杰，等.HPLC测定四方藤中3种岩白菜素类化合物的含量[J].广西师范大学学报(自然科学版)，2015，33(1)：99-103.
[11]罗培，黄华奎，黄俊，等.HPLC法测定四方藤中岩白菜素和白藜芦醇的含量[J].广西师范大学学报(自然科学版)，2014，32(1)：91-94.
[12]范卫锋.高效液相色谱法测定广西四方藤中岩白菜素的含量[J].湖北中医药大学
学报，2013，15(1)：31-32.。