福寿螺检疫鉴定方法-最新国标

福寿螺检疫鉴定方法
1 范围
本文件明确了小管福寿螺和斑点福寿螺的检疫鉴定方法。

本文件适用于植物检疫工作小管福寿螺和斑点福寿螺的检疫鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27402 实验室质量控制规范植物检疫
3 术语和定义
下列术语与定义适用于本文件。

3.1形态学
3.1.1
贝壳shell
螺的保护器官，为螺旋形结构，可分螺旋部和体螺层。

螺旋部为内脏器官盘存之处，通常可以分成几个螺层；体螺层为贝壳的最后一个螺层，一般较大，容纳头部和足部。

3.1.2
厣甲operculum
角质化的薄片，内凹的卵圆形，用以封闭壳口。

具有同心圆的生长线，厣核偏于内侧中部，具有雌雄二型性，雄性成螺在近外侧中部隆起，外缘向壳口内折翻。

3.1.3
齿舌radula
螺用来帮助进食的解剖结构，由微小几丁质“齿”排成链状，像锉一样把食物挖起或切开，然后直接运送到食道内。

齿舌的性状和结构是分类的重要依据之一。

3.1.4
阴茎penis
螺雄性生殖器官。

阴茎系统一般由阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌和鞭状体组成。

3.1.5
阴茎鞘腺penis sheath glands
包裹阴茎的围鞘上用于分泌雄性激素的器官，通常具多个。

雄性外生殖鞘的形状和结构是分类的重要依据之一。

3.1.6
肾脏kidney
螺用于代谢的解剖结构，分前肾和后肾，前肾略小，后肾大且具裂口。

3.1.7
外套膜mantle
螺覆盖体外的膜状物，背缘与内脏团背面的上皮组织相连，由内外两侧表皮和中央的结缔组织以及少数的肌纤维所构成
3.1.8
卵块egg clutch
螺体外产卵于水面上方的植物茎干、石壁等固体附着物上，形成的一簇紧密排布具钙质外壳的卵，初产卵块呈鲜粉红色，随着发育卵周液逐渐吸收而颜色变浅。

3.2缩略语
DNA：脱氧核糖核酸
PCR：聚合酶链式反应
COI：细胞色素氧化酶亚基I
KOH：氢氧化钾
NaOH：氢氧化钠
4 福寿螺基本信息
福寿螺属Pomacea Pery 1810，在分类上隶属于腹足纲Gastropoda，新进腹足目Caenogastropoda，瓶螺科Ampullariidae，该属共计96种。

其中，入侵性福寿螺主要包括小管福寿螺P. canaliculata和斑点福寿螺P. maculata两种。

4.1小管福寿螺
学名：Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822)
英文名：channeled apple snail
异名：Ampullaria canaliculata，Ampullaria gigas，Ampullaria insularum，Ampullaria levio，Pila canaliculata，Pomacea cuprina，Pomacea gigas，Ampullaria gigas
4.2斑点福寿螺
学名：Pomacea maculata Perry, 1810
英文名：spotted apple snail
异名：Ampullaria amazonica Reeve, 1856，Ampullaria castelnaudii Hupé, 1857，Ampullaria crosseana Hidalgo, 1871，Ampullaria georgii Williams, 1889，Ampullaria gigas Spix，Ampullaria insularum d’Orbigny, 1835
5 方法原理
福寿螺为淡水腹足类，具有两栖生活习性，在空气中产卵，可附着于植物茎干等固体附着物上。

幼成螺及卵块容易随种苗调运、附着于船舶等传播，寄主范围广。

传播方式和传播途径是确定现场检疫方式的依据。

贝壳形态、软体解剖特征是鉴定福寿螺种类的主要依据，基于DNA条形码鉴定的分子生物学方法作为形态鉴定的辅助手段。

当螺形态完好，在成螺发育阶段，具有贝壳、厣甲、齿舌等器官，可以仅使用形态鉴定方法。

当螺形态不完整，或在卵、幼螺期，或仅有部分组织时，需要采用分子生物学鉴定方法。

6 器具和试剂
6.1仪器
体视显微镜、光学显微镜、电子天平、超声波清洗机、水浴锅、高压灭菌锅、干燥箱、离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、涡旋振荡器、冰箱等。

6.2用具
解剖刀、解剖针、解剖剪、镊子、白瓷盘、烧杯（500 mL、1000 mL）、玻璃棒、电热水壶、放大镜、培养皿、软毛刷、牙膏、指形管、滤纸、标签、记录纸、游标卡尺、标本瓶、样品盒、样品袋、可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL）、可调移液器枪头、1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管。

6.3试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。

10%的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、75%乙醇、无水乙醇、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR反应液、灭菌水、琼脂糖、TAE溶液。

7 现场检测
对来自疫区的运输工具和货物实施重点查验。

仔细检查运输工具、种苗等是否有螺或卵块附着其上。

螺卵孵化后会留下白色的痕迹，这是判定是否有福寿螺污染的重要依据。

发现螺，随时装入塑料自封袋或标本瓶，带回实验室做进一步的检验鉴定。

8 实验室鉴定
8.1测量观察和软体解剖
用游标卡尺测量螺壳的壳长和壳宽、卵粒长和宽。

用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征。

用热激法处理螺，解剖获得完整的软体组织，将阴茎鞘从外套膜右侧底部翻出。

将卵块置于适量10% KOH或10% NaOH溶液中，浸泡3～5 min后可将卵粒分离。

8.2小管福寿螺P. canaliculata的鉴定特征
8.2.1螺壳形态
外形呈卵圆球形，壳质较薄，壳色多变，呈黄色、暗绿色、黄棕色等，成螺高约35-60 mm，有5～6个螺层，均外凸，螺层在宽度上增长迅速，螺旋部较低矮，体螺层极膨大，占全部壳高带84～93%。

各螺层上部呈肩状，体螺层肩部最明显，体螺层肩部圆弧形。

壳面较光滑或具有细小的轴向生长线，有的具螺旋状暗带，暗带颜色多变，呈暗红色、暗绿色或暗褐色。

壳口大，近卵圆形。

内唇上方贴覆于体螺层上，形成薄的胼胝，内唇无染色。

8.2.2厣甲形态
厣甲中间略厚，边缘薄，厚度不均一，有韧性，深棕色，能紧密地封闭壳口。

内表面光滑，与腹足相贴的疤痕卵圆形，近柱状边缘。

8.2.3雄性生殖器形态
雄性生殖器官由精巢、输精管、前列腺囊、前列腺和阴茎等组成。

阴茎是体前端右侧外套膜上形成的一个肌肉质突起，粗大而呈长三角形。

在阴茎的侧面中央有一条开放式的纤毛沟，起始于基部，约占阴茎总长度的2/3。

具阴茎鞘腺顶腺和中腺，无基腺。

顶腺约占阴茎鞘腹侧末端的1/2，表面具褶皱；中腺位于阴茎鞘腹侧中间，纤毛沟的右侧，卵圆形表面光滑。

8.2.4齿舌形态
呈带状，每一横列含有1个中央齿，中央齿两侧对称排列1个侧齿和2个缘齿。

中央齿第一突起宽而短，从基底部到顶端呈外凸弧形弯曲。

8.3斑点福寿螺P. maculata的形态鉴定特征
8.3.1螺壳形态
外形呈圆球形，壳质较厚而坚固，呈黄棕色，成螺高～35 mm，有5～6个螺层，均外凸，螺层在宽度上增长迅速，螺旋部低矮，体螺层极膨大，占全部壳高带89~97%。

各螺层上部呈肩状，体螺层肩部最明显，体螺层肩部呈角形。

壳面较光滑或具有细小的轴向生长线，有的具螺旋状暗带，暗带颜色多变，呈暗红色、暗绿色或暗褐色。

壳口大，近卵圆形。

内唇上方贴覆于体螺层上，形成薄的胼胝，内唇染有黄色或红橙色。

8.3.2厣甲形态
厣甲厚度均一，无韧性，深棕色，能紧密地封闭壳口。

8.3.3雄性生殖器形态
阴茎鞘腺具顶腺和基腺，无中腺体。

顶腺约占阴茎鞘腹侧末端的1/2，表面具褶皱；基腺位于阴茎鞘腹侧基部，纤毛沟的偏右侧，表面较光滑。

8.3.4齿舌形态
中央齿第一突起宽而短，从基底部到顶端呈内凹弧形弯曲。

9 结果评定
以成螺形态外生殖器解剖形态为基本鉴定依据，螺壳和卵形态及分子特征辅助鉴定，并注意小管福寿螺和斑点福寿螺两种之间的鉴别（参见附录C）。

符合8.2.3形态特征或同时符合8.2.1、8.2.2、8.2.4形态特征的福寿螺鉴定为小管福寿螺P. canaliculata；符合8.3.3形态特征或同时符合8.3.1、8.3.2、8.3.4形态特征的福寿螺鉴定为斑点福寿螺P. maculata。

10 标本处理与保存
10.1标本处理
10.1.1形态鉴定标本制作
采用热激法解剖福寿螺。

取活体螺放置于1000 mL烧杯底部，待螺腹足及头部伸出厣甲或爬行时，将沸水快速倒入烧杯2/3处，用玻璃棒快速搅拌或轻晃动烧杯3~5 min，让软体组织与螺壳分离；将螺转移并浸没到75%乙醇溶液中数分钟，用镊子顺螺旋的方向将软体组织完整分离出来。

将软体组织继续浸泡于75%乙醇溶液中脱水，每24h更换一次乙醇溶液，共换2～3次，便可长期保存于75%乙醇溶液中；使用软毛刷清理螺壳、厣甲表面的泥土、藻类、残留组织等附着物，必要时使用少量牙膏；使用流水冲洗螺壳内部，如螺壳内有组织残留，可使用超声波清洗机清洗干净；将清洗干净的螺壳和厣甲自然风干。

10.1.1分子鉴定标本制作
成螺：解剖获取腹足或外套膜等组织，用解剖剪剪成碎片，置于离心管中，使用无水乙醇保存。

幼螺：个体较大的幼螺可取组织保存于无水乙醇，个体较小的幼螺可将外壳敲碎或打孔后直接浸泡于无水乙醇。

卵的处理：使用10%的KOH或NaOH溶液分离卵块中的卵粒，用灭菌水漂洗3遍，再用75%的乙醇漂洗2遍后晾干，置于-20o C冰箱中存放灭活胚胎并长期保存。

10.2标本保存
经处理后的标本，至少妥善保存6个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。