利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1128−1136/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01128
利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性
柳武革1王丰1,*金素娟1,2朱小源3李金华1刘振荣1廖亦龙1朱满山1黄慧君1符福鸿1刘宜柏2
(1广东省农业科学院水稻研究所, 广东广州510640; 2江西农业大学, 江西南昌330045; 3广东省农业科学院植物保护研究所, 广东
广州510640)
摘要: 以含广谱稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2的BL122为供体, 温敏核不育系GD-7S为受体, 通过杂交、回交和自
交并结合分子标记辅助选择, 将Pi-1、Pi-2基因导入温敏核不育系GD-7S中, 获得5个携带两个抗性基因的纯合改
良不育株系。

利用34个广东代表性稻瘟病菌株接种鉴定, 5个改良株系的抗性频率为94.12%~97.06%, 而对照GD-7S
抗性频率仅为17.65%; 自然病圃诱发鉴定5个改良株系的叶瘟和穗颈瘟均为0级, 表现高抗。

经自然条件和人工气
候箱育性鉴定, 改良株系与对照均为无或少花粉败育类型, 自交结实率为0, 说明不育起点温度与对照基本一致。

统
计分析表明, 除剑叶长和每株穗数外, 改良株系与对照在其他农艺性状方面均无显著差异。

与恢复系L38杂交, 改良
株系的杂种F1与对照的F1大多农艺性状无显著差异, 说明改良株系基本保持了GD-7S的农艺性状和配合力。

关键词:分子标记辅助选择; 基因聚合; Pi-1; Pi-2; 两系不育系; 稻瘟病抗性
Improvement of Rice Blast Resistance in TGMS Line by Pyramiding of Pi-1 and Pi-2 through Molecular Marker-Assisted Selection
LIU Wu-Ge1, WANG Feng1,*, JIN Su-Juan1,2, ZHU Xiao-Yuan3, LI Jin-Hua1, LIU Zhen-Rong1, LIAO Yi-Long1, ZHU Man-Shan1, HUANG Hui-Jun1, FU Fu-Hong1, and LIU Yi-Bai2
(1 Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong; 2 Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, Jiangxi; 3 Plant Protection Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China)
Abstract: Blast is one of the most serious diseases of rice worldwide, which usually leads to a sharp decline in rice production and even results in no yield. Breeding blast-resistant varieties is one of the most effective and economical ways to control the dis-ease. In this study, the BL122 contained two blast resistance genes Pi-1 and Pi-2 was used as gene donor to be crossed and then backcrossed with the TGMS line GD-7S. Five improved TGMS lines with Pi-1 and Pi-2 homozygous genotype were successfully developed through molecular marker-assisted selection. The resistance frequency of the improved TGMS lines ranged from 94.12% to 97.06%, much higher than that of the check GD-7S, which was only 17.65%,by artificially inoculating 34 representa-tive blast isolates collected in Guangdong Province. The improved TGMS lines also displayed high resistance to leaf and neck blast in the epidemic areas. The critical temperature of fertility transformation for the improved TGMS lines from fertile to sterile was preliminarily identified in the phytotron with the regime of 12.5 h/23℃ and natural conditions. The results showed that the critical temperature point for the improved TGMS lines was likely consistent with that of the check GD-7S. The statistical analysis showed there was no significant difference in the agronomic traits between improved TGMS lines and GD-7S except the flag leaf length and number of panicles per plant. Moreover, there was also no significant difference in most of the agronomic traits be-tween the F1s derived from the crosses of the same restorer line L38 with both the check GD-7S and the improved TGMS lines, respectively. All these indicated that the improved TGMS lines retained almost the same agronomic traits and combining ability as
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA100101); 国家科技支撑计划项目(2006BAD01A01-4); 广东省科技攻关计划项目(2006A20202001, 0711124900076); 广东省自然科学基金项目(04101156)
作者简介:柳武革(1974–), 男, 山西运城人, 硕士, E-mail: liuwuge@
*通讯作者(Corresponding author):王丰(1963–), 男, 江西安福人, 博士, 研究员, 主要从事水稻杂种优势利用与分子育种研究。

Tel：
020-********, E-mail: fwang1631@
Received(收稿日期): 2007-09-25; Accepted(接受日期): 2007-12-05.
第7期柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性1129
the check.
Keywords: Molecular marker-assisted selection; Gene pyramiding; Pi-1; Pi-2; TGMS line; Blast resistance
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea (其无性世代为Pyricularia grisea) 引起的真菌性病害, 在世界各个水稻生产国家或地区均有发生。

在流行年份, 稻瘟病造成的产量损失一般为10%~20%, 严重的可达50%以上, 局部田块甚至颗粒无收, 而且导致稻米品质下降[1]。

我国稻瘟病年发生面积400万公顷左右, 严重年份800万公顷左右, 每年因稻瘟病危害损失稻谷2~10亿千克[2]。

实践证明, 培育与种植抗病品种是最经济有效的防治稻瘟病措施。

然而, 大多抗病品种推广数年后抗性会逐步丧失, 其主要原因是大面积种植的品种往往抗病基因相对单一, 使得稻瘟病菌群体中的毒性小种逐渐成为优势小种, 造成病害流行。

因此选育持久抗病品种是育种工作者一贯追求的目标。

研究表明, 持久抗性与多个抗病基因协同作用密切相关。

许多具有持久抗性的种质如Moroberekan、Tetep、IR64、三黄占等都具有多个抗病基因[3-4]。

因此聚合多个抗性基因对于培育持久抗性品种具有非常重要的意义。

随着DNA分子标记技术的出现与迅猛发展, 利用经典的稻瘟病遗传分析方法与分子标记技术相结合, 目前至少已经标记定位50个稻瘟病抗性基因[4-6], 其中来源于西非粳稻品种LAC23的Pi-1 和哥伦比亚籼稻品种5173的Pi-2基因是两个显性广谱高抗稻瘟病基因[7-8]。

Pi-1定位在第11染色体长臂末端, 位于RFLP标记G181和RZ536之间[7], 刘士平等[9]在此基础上发展了与Pi-1连锁的SSR标记RM144, 并利用分子标记辅助选择将Pi-1基因导入珍汕97B。

Pi-2定位在第6染色体RG64和RG612标记之间, 遗传距离分别为2.1 cM和7.2 cM[8], 吴金红等[10]和Jiang等[11]进一步开发了与Pi-2紧密连锁的SSR标记AP22和SSR140。

这些以PCR为基础、操作简便、多态性丰富的SSR标记的开发, 为Pi-1和Pi-2基因的分子标记辅助选择提供了理想的条件。

近年来, 我国两系杂交稻育种取得了长足的进展, 先后育成了以两优培九、培两优288、丰两优1号和扬两优6号为代表的两系杂交稻先锋组合在生产上大面积推广应用。

然而, 除培矮64S外, 大多数两系不育系的稻瘟病抗性仍然较差, 所组配出的杂种F1抗性也不够理想。

因此改良这类两系不育系的稻瘟病抗性具有重要意义。

GD-7S是广东省农业科学院水稻研究所育成的优质温敏核不育系, 该不育系粒型细长, 米质优, 分蘖力强, 株型矮直, 配合力好, 但不抗稻瘟病。

为此, 本研究期望通过杂交、回交和分子标记辅助选择育种技术, 将抗瘟基因Pi-1和Pi-2聚合到GD-7S中, 获得具有持久稳定的稻瘟病抗性的两系不育系, 为高产、优质、抗病两系杂交稻的发展提供亲本材料。

1材料与方法
1.1水稻材料
含稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2的供体亲本BL122是由国际水稻研究所育成的多基因累加系, 其遗传背景为籼稻品系CO39, 在广东多年鉴定表现持久高抗稻瘟病特性, 种子由广东省农业科学院植物保护研究所提供, 受体亲本两系不育系GD-7S 由广东省农业科学院水稻研究所育成提供。

1.2抗性基因连锁标记
与稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2紧密连锁的标记分别是RM144和AP22[9-10], 引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.3分子标记检测
采用简易SDS抽提法提取水稻幼嫩叶片DNA。

参照Panaud等[12]的方法稍加修改进行PCR。

20 μL 的反应体系含0.2 μmol L−1的正、反向引物各1.5 μL, 200 μmol L−1 dNTP 2 μL, 10×PCR buffer (50 mmol L−1 KCl, 10 mmol L−1 Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mmol L−1 MgCl2,
表1水稻稻瘟病抗性基因的连锁标记及引物序列
Table 1 Linked markers of rice blast resistance gene and their primer sequences
基因Gene
标记
Marker
所在克隆
Clone
片段长度
Length (bp)
基序
Motif
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
Pi-1 RM144 AC134045 237 (ATT)11 F:
TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC
R: GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG Pi-2 AP22 AP003522 143 (GCC)9 F:
GTGCATGAGTCCAGCTCAAA
R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC
1130
作 物 学 报 第34卷
0.01%明胶) 2 μL, 50~100 ng 的DNA 模板2 μL, 1 U μL −1的Taq DNA 聚合酶0.3 μL, ddH 2O 10.7 μL 。

反应程序为94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 55℃复性1 min, 72℃延伸2 min, 进行35个循环, 最后72℃延伸5 min 。

PCR 扩增产物在6%聚丙烯酰胺变性测序胶上电泳分离, 银染后记录结果。

其中, 受体亲本GD-7S 的纯合感病带型记为1, BL122的纯合抗病带型记为3, 杂合带型记为2。

1.4 杂交、回交与选择方案
GD-7S×BL122获得F 1, 然后以GD-7S 为母本与F 1回交获得BC 1F 1。

由于轮回亲本GD-7S 是两系不育系, 其不育性受一对隐性基因控制, 在各回交世代中会出现不育和可育株的分离。

为加快改良进程, 在此后的回交过程中, 通过单株的表现和分子标记检测结果, 在各回交世代中同时携带Pi-1和Pi-2两个抗性基因且农艺性状与轮回亲本接近的可育单株进行回交, 回交3代和4代后选择同时携带2个目的基因的不育单株进行割蔸再生与冷灌 繁殖。

整个改良过程包括1次杂交产生F 1, 4次回交和多次自交, 最后获得抗稻瘟病的RGD-7S 株系(图1)。

2001年早季 Early season in 2001 GD-7S × BL122
杂交 Crossing 2001年晚季 Late season in 2001
GD-7S × F 1 回交 Backcrossing
2002年早季 Early season in 2002
GD-7S × BC 1F 1 分子检测选择两个基因杂合的可育单株进行回交。

Fertile plants with two genes were backcrossed with GD-7S. 2002年晚季 Late season in 2002 GD-7S × BC 2F 1 结合农艺性状表现，选择两个基因杂合的可育单株继续回交。

Fertile plants with good agronomic traits and two genes were backcrossed with GD-7S.
2003年早季 Early season in 2003
3
F 1 选择两个基因杂合的可育单株继续回交，两个基因杂合的不育单株在广东乳源再生冷灌繁种获得BC 3F 2种子，进一步分子检测筛选纯合单株。

Backcrossed were continued. BC 3F 2 seeds were obtained by cold water irrigation of sterile plants with heterozygous resistant genotype of two genes in Ruyuan, Guangdong province. Homozygous resistant plants were screened through MAS in BC 3F 2 population.
2003年晚季 Late season in 2003 BC F 1 分子检测选择两个基因杂合的不育单株海南三亚再生繁种。

Sterile plants with two genes were multiplied in Sanya, Hainan province.
2004年早季 Early season in 2004 BC F 2 分子检测筛选两个基因纯合的不育单株晚季在广东乳源再生繁种。

Plants of homozygous genotype at the 2 resistant loci screened through MAS in BC 4F 2 population were multiplied by cold water irrigation in Ruyuan, Guangdong province.
2005年早季 Early season in 2005 BC 4F 3 各株系广州种植育性检测，同时在海南三亚繁种，获得更多纯合株系种子。

Male sterility of the improved lines was identified in Guangzhou. At the same planting season, all the improved lines were multiplied to produce more seeds in Sanya, Hainan province.
图1 分子标记辅助选择聚合两个稻瘟病抗性基因的育种程序
Fig. 1 Breeding procedure of pyramiding two blast resistance genes by molecular marker-assisted selection
1.5 稻瘟病抗性鉴定
2006年晚季进行人工接种鉴定, 所用的34个稻瘟病菌株为广东近年来具有代表性的菌株, 由广东省农业科学院植物保护研究所保存, 包括ZA 群2个、ZB 群20个、ZC 群11个和ZF 群1个。

将聚合了两个抗性基因的改良株系和原始GD-7S 同时浸种、催芽后播种于塑料盘中, 每个材料20~30苗, 待幼苗长至三叶一心期, 采用高压喷雾的方法, 用浓度为2×105 mL −1的孢子悬液(含0.05%的粘附剂Tween-20)接种水稻叶片, 接种后于25℃左右的温室
培养5~7 d, 其间定时用喷雾器喷水保持水稻叶片的湿度利于发病。

按0~5级标准调查病情, 0~3级为抗病, 4~5级为感病, 同时计算株系的抗性频率[13]。

选择广东省粤东北稻作区的龙川县农科所稻瘟病鉴定圃进行自然病圃鉴定, 按国际水稻所0~9级的分级标准调查叶瘟和穗颈瘟。

1.6 育性鉴定
2006年晚季对抗性改良株系和原始GD-7S 同时在自然条件下和人工气候箱中进行育性初步鉴定。

人工气候箱用于幼穗分化Ⅲ期末至抽穗的处理, 光
第7期柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性1131
照12.5 h, 温度23(
℃变幅为19~27)
℃。

用1% I2-KI 溶液进行花粉染色, 在显微镜下检测花粉育性。

同时对每个株系在开花前随机套袋10穗, 30 d后统计每穗总粒数和实粒数, 计算自交结实率。

1.7农艺性状
2006年早季, 利用导入了Pi-1与Pi-2基因的5个抗病GD-7S株系与感病恢复系L38杂交获得杂种F1代种子, 晚季将各组合的杂种F1及5个改良不育株系种植于广东省农业科学院大丰基地, 按随机区组设计, 3次重复。

常规水肥管理, 成熟后取样考查株高、剑叶长、穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重、单株产量等农艺性状。

采用DPS数据处理系统分析数据[14]。

2结果与分析
2.1分子标记辅助选择体系的建立
利用与Pi-1、Pi-2紧密连锁的SSR标记RM144、AP22对抗性基因供体亲本BL122与受体亲本GD-7S进行多态性分析, 结果如图2所示。

RM144在供体亲本中扩增出的产物较大, 在受体亲本GD-7S中所扩增出的产物较小, 供体和受体之间的带型具有明显的多态性; AP22引物在供体BL122和受体GD-7S中的PCR扩增产物电泳带型之间亦有明显的差异。

由于标记RM144与Pi-1基因之间仍有6.8 cM 的遗传距离, 为了确认标记的选择效率, 选用单个特异鉴别菌株对F2群体接种, 从中选择100个表现典型感病的单株进行标记检测, 发现有95株表现感病亲本标记带型, 只有5株发生交换, 准确率高达95%。

同样AP22对Pi-2基因的选择准确率高达97%。

说明利用RM144和AP22分别对Pi-1和Pi-2基因进行分子标记辅助选择改良GD-7S是完全可行的。

2.2各世代的分子标记选择
利用与抗性基因紧密连锁的标记对不同回交世代进行选择, 结果如表2所示。

在BC1F1、BC2F1、BC3F1和BC4F1各个回交世代中, 杂合带型(带型2)与感病带型(带型1)的分离比例均符合11
∶。

由于轮回亲本GD-7S是两系不育系, 其不育基因的遗传受一对隐性基因控制, 各个回交世代会出现不育株和可育株的分离。

育种过程中筛选含有两个抗性基因标记、农艺性状更接近GD-7S的可育单株继续进行回交。

为了确保2个抗性基因的存在, 必须保证一定规模的回交选择群体, 通常选择2~4个可育单株进行回交, 同时尽可能获得更多的杂交种子。

在BC3F1和BC4F1两个回交群体中, 根据分子标记检测结果、农艺性状表现和花粉育性镜检结果分别选择了3株和4株完全不育单株进行稻蔸繁殖, 分别获得BC3F2和BC4F2不育株系种子。

继续种植3个BC3F2和4个BC4F2群体, 对这些世代进行分子标记检测, 各个分离世代均出现3种带型(图2), 即与供体亲本相同的纯合抗病带型、抗感杂合带型和与受体亲本相同的纯合感病带型, 分离比例符合121(
∶∶表3)。

通过育性镜检和农艺性状观察, 筛选获得RGD7S-1、RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和RGD7S-5等5个纯合抗病带型不育单株, 进一步稻蔸冷灌繁殖, 至2006年早季, 5个改良不育株系的BC4F3代在主要农艺性状上已基本稳定。

图2抗性基因连锁标记在BC4F2群体中的分离
Fig. 2 Segregation of the linkage marker for the resistance gene in BC4F2 population
P1：GD-7S; P2：BL122; 1：纯合感病基因型; 2：杂合基因型; 3：纯合抗病基因型。

P1: GD-7S; P2: BL122; 1: homozygous susceptible genotype; 2: heterozygous genotype; 3: homozygous resistant genotype.
1132
作 物 学 报
第34卷
表2 各回交世代群体分子标记检测分析结果
Table 2 Results of molecular marker analysis in different backcross populations
RM144 (Pi-1)
AP22 (Pi-2)
世代 Generation 编号 Code 株数
Number of plants
2a) 1a)
χ2 (1:1)
2a) 1a)
χ2 (1:1)
双基因杂合单株
Number of heterozygous plants
BC 1F 1 G35 104 60 44 2.46 50 54 0.15 28 BC 2F 1 D41
152
69 83 1.29 77 75 0.03 30 D42 189 98 91 0.26 104 85 1.91 43 BC 3F 1 G2
185
101 84 1.56 90 95 0.14
45 G3 208 102 106 0.08 98 110 0.69 48 BC 4F 1 D5
163
72 91 2.21 28+44+ — 28 D6 170
80 90 0.59 41+
39+ — 41 D7 218 102 116 0.90 60+42+ — 60 D8 186
90 96 0.19 44+
46+ —
44
a)
2: 表示带型2, 杂合基因型; 1: 表示带型1, 纯合感病基因型; +: 表示只对回交群体中RM144座位为杂合的单株进行标记
AP22检测的结果。

a)
2 means band type 2, heterozygous genotype; 1 means band type 1, homozygous susceptible genotype; + means the results of analysis
with marker AP22 for the plants only with the heterozygous genotypes at locus RM144 in the backcross population.
表3 BC 3F 2和BC 4F 2群体的分子标记检测分析结果
Table 3 Results of molecular marker analysis in BC 3F 2 and BC 4F 2 population
RM144 (Pi-1)
AP22 (Pi-2)
世代 Generation
编号 Code 株数
Number of plants
3a) 2a) 1a)
χ2
(1:2:1)
3a)2a)1a)χ2
(1:2:1)
双基因纯合单株 Number of homozygous
plants
BC 3F 2 G17 152
33 74 45 2.00 44
8028 3.79
8 G18 250 55 135 60 1.80 5814151 4.49 15 G19 201 45 98 58 1.81 619545 3.15 10 BC 4F 2 G61
315
70 161 84 1.40 91
15965 4.32 18 G62 210 50 99 61 1.84 6310344 3.51 12 G63 238 49 119 70 3.71 55123600.48 12 G64 204 56 100 48 0.71 62
101
41
4.34
10
a) 3：表示带型3, 纯合抗病基因型; 2：表示带型2, 杂合基因型; 1：表示带型1, 纯合感病基因型。

a)
3 means band type 3, homozygous resistant genotype; 2 means band type 2, heterozygous genotype; 1 means band type 1, homozy-gous susceptible genotype.
2.3 抗性鉴定
人工接种鉴定结果如表4所示。

对照GD-7S 仅对34个菌株中的6个表现抗病, 抗性频率仅为17.65%; 而聚合了Pi-1与Pi-2的5个改良株系, 只有1~2个菌系可以侵染, 其抗性频率高达94.12%~ 97.06%。

其中, 菌株01-8a 对所有5个改良株系和对照均能侵染; 菌株00-148a 对其中4个改良株系不侵染, 只对RGD7S-1和对照GD-7S 侵染。

此外, 在龙川稻瘟病鉴定圃自然诱发鉴定中, RGD7S-1、RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和RGD7S- 5等5个改良株系的叶瘟和穗瘟为0级, 而对照GD- 7S 则分别为9级和7级。

2.4 抗稻瘟病改良株系的育性与主要农艺性状
原始GD-7S 属温敏核不育系, 在高温长日条件
下花粉败育类型表现为无或少花粉型。

5个改良株系无论在人工气候箱处理条件下, 还是自然条件下, 花粉败育类型均表现为无或少花粉型, 多个视野偶然可以看见几粒典败不育花粉, 自交结实率也全部为0。

说明改良株系的雄性不育起点温度与原始不育系GD-7S 基本一致, 在华南稻区可以安全制种应用。

对改良不育株系和对照GD-7S 的农艺性状分 析表明(表5), 除RGD7S-1和RGD7S-5剑叶变短、RGD7S-4穗数增加, 表现与对照差异达显著水平外, 其余多数性状改良株系与对照无显著差异。

2.5 改良株系所配杂种F 1的主要农艺性状
原始不育系GD-7S 及其聚合了Pi-1和Pi-2两个基因的改良株系分别与恢复系L38杂交, 对F 1的
第7期
柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性 1133
表4 含Pi-1和Pi-2基因的改良株系及GD-7S 对广东34个
菌株的抗性反应
Table 4 Disease reactions of improved lines with Pi-1, Pi-2, and GD-7S to 34 blast isolates collected in Guangdong province 改良株系Improved line
菌株 Isolate
GD-7S (CK) RGD7 S-1 RGD7 S-2 RGD 7S-3 RGD 7S-4 RGD
7S-5
00-120a R a
R R R R R 00-135a R R R R R R 00-148a S a
S R R R R 00-164a S R R R R R
00-179a S R R R R R 00-309a S R R R R R 00-90a S R R R R R 01-111a S R R R R R 01-151a R R R R R R 01-165a S R R R R R 01-198a S R R R R R 01-216s S R R R R R
01-8a S S S S S S 02-52a S R R R R R 02-54a S R R R R R 04-135b S R R R R R 04-141a S R R R R R 04-145a R R R R R R 04-185a S R R R R R 04-218a R R R R R R
04-63a S R R R R R
04-77a S R R R R R 93-203a R R R R R R
93-284a S R R R R R 93-286a S R R R R R 95-59a S R R R R R 97-230a S R R R R R 97-235 S R R R R R 98-148a S R R R R R 98-1a S R R R R R
98-288a S R R R R R
98-37a S R R R R R
98-44a S R R R R R
Y-98-66a S R R R R R 可致病菌株数No. of infected
isolates
28 2 1 1 1 1
抗性频率
Resistance
frequency (%)
17.65 94.12 97.06 97.06 97.06 97.06a)
R 和S 分别表示抗病和感病。

a) R and S stand for a resistance reaction and a susceptible
reaction, respectively.
农艺性状考查结果表明(表6), 在株高、剑叶长、穗数、千粒重和单株产量等方面无显著差异, 只在穗长、每穗粒数和结实率等3个性状方面, 部分改良株系所配杂种与对照差异显著。

如RGD7S-2/L38的穗长与对照GD-7S/L38差异达到显著水平, 表现为穗长增长; RGD7S-1/L38的结实率与对照GD-7S/ L38的差异达显著水平, 表现为结实率降低, 但单株产量与对照无显著差异。

改良RGD7S-5/L38的每
穗实粒数比对照的每穗实粒数明显减少, 差异也达
显著水平。

此外, 龙川稻瘟病鉴定圃田间抗性鉴定
表明, 5个改良株系所配杂种F 1的叶瘟和穗瘟为0级, 而对照GD-7S 所配杂种F 1则分别为9级和7级。

总的来说, 导入Pi-1、Pi-2两个基因后对其杂种后代
主要农艺经济性状无显著影响。

3 讨论
3.1
Pi-1和Pi-2基因的抗病特点及聚合效应 Pi-1基因源自西非粳稻品种LAC23, Pi-2基因
则源自哥伦比亚籼稻品种5173。

研究表明Pi-1与Pi-2是两个显性广谱稻瘟病抗性基因。

刘士平等[15]利用来自中国、日本和国际水稻所75个稻瘟病菌株, 发现Pi-1和Pi-2的抗谱分别高达82.67%和85.53%。

周江鸿等[16]
用多个稻瘟病近等基因系和单基因系对
我国南、北方稻区
322个单孢菌株进行毒力测定, 对
Pi-2的毒力频率为6.83%, 表现弱毒力, 而对Pi-1的
毒力频率为22.36%, 表现中等毒力。

Chen 等[17]利用我国中南部715个菌株接种结果表明, Pi-1和Pi-2的侵染率为7.55%和10.35%, 将两个基因聚合后的
侵染率仅为1.96%。

朱小源等[18]利用来自广东的146个稻瘟病菌株对17个抗稻瘟病的单基因系进行接种鉴定, 结果携带Pi-1的品系IRBL1-CL 抗性频率为80.1%, 而携带Pi-2的品系IRBLz5-CA 抗病频率
为48.6%, 但二者在对不同生理小种的抗性上具有
很好的互补效应, 并对华南稻区的抗性改良推荐选
用Pi-1和Pi-2基因。

因此, Pi-1和Pi-2基因在我国水稻生产中具有重要的应用价值和较好的应用前景。

本研究利用分子标记辅助选择将Pi-1和Pi-2基因聚合到感病不育系GD-7S 中, 人工接种鉴定表明5个改良株系抗病频率达94.12%~97.06%, 自然病圃叶瘟和穗瘟均为0级, 综合评价达高抗水平。

有研究表明, 多个抗性基因聚合后, 并不只是单个抗病
1134作物学报第34卷
表5改良不育株系和原始GD-7S农艺性状比较
Table 5 Comparison of agronomic characters between the improved lines and the check GD-7S
性状Trait GD-7S RGD7S-1 RGD7S-2 RGD7S-3 RGD7S-4 RGD7S-5 株高Plant height (cm) 77.0 a 68.4 a 72. 0 a 74.6 a 68.2 a 70.6 a
剑叶长Flag leaf length (cm) 37.7 b 33.3 a 38.0 ab 35.7 ab 36.0 ab 34.7 a
穗数No. of panicles 10.0 b 10.3 ab 11.0 ab 10.7 ab 12.0 a 11.3 ab
穗长Panicle length (cm) 21.5 a 22.8 a 22.0 a 20.9 a 23.7 a 23.2 a
每穗粒数Grains per panicle 128.4 a 130.2 a 128.5 a 118.5 a 122.9 a 123.8 a
数据后带不同小写字母者差异在0.05水平显著。

Values followed by a different small letter are significantly different at 5% probability level.
表6改良不育株系与对照GD-7S所配杂种F1的农艺性状和田间抗性表现
Table 6 Performance of agronomic characters and field blast resistance for the hybrid F1 derived from the improved lines and GD-7S
性状Trait GD-7S/L38 RGD7S-1/L38RGD7S-2/L38RGD7S-3/L38RGD7S-4/L38 RGD7S-5/L38株高Plant height (cm) 107.2 a 106.3 a 108.7 a 109.9 a 107.6 a 107.1 a
剑叶长Flag leaf length (cm) 36.8 a 36.1 a 38.5 a 38.3 a 39.2 a 37.9 a
穗长Panicle length (cm) 23.8 b 23.4 b 24.9 a 24.1 b 23.9 ab 23.5 b
穗数No. of panicles 8.9 a 9.6 a 9.0 a 9.2 a 9.6 a 9.3 a
每穗粒数Grains per panicle 159.3 ab 146.0 bc 168.0 a 149.4 bc 159.1 bc 136.9 c
千粒重1000-seed weight (g) 23.80 ab 23.64 b 24.33 a 24.23 ab 24.09 ab 24.05 ab 结实率Seed set rate (%) 90.4 a 84.4 b 90.5 a 86.7 ab 88.4 ab 86.2 ab 单株产量Yield/plant (g) 32.3 abc 31.7 bc 35.8 a 32.2 abc 35.5 ab 29.7 c
叶瘟Leaf blast 9 0 0 0 0 0 穗瘟Neck blast 7 0 0 0 0 0
数据后带不同小写字母者差异在0.05水平显著。

Values followed by a different small letter are significantly different at 5% probability level.
基因抗谱之间的简单累加, 而表现出极显著的基因互作, 使其能够抵抗单个抗病基因所不能抵抗的多种生理小种[15]。

因此聚合了Pi-1和Pi-2抗性基因的改良新不育系, 可能会具有相对稳定的持久抗病特性。

3.2Pi-1和Pi-2基因不同聚合株系的抗性差异
理论上, 在相同遗传背景下导入两个相同稻瘟病抗性基因Pi-1与Pi-2的所有改良株系应该对供试的稻瘟病菌株具有相同的抗性反应。

但本研究发现, 同时携带Pi-1与Pi-2的5个改良株系对于其中一个菌株00-148a的抗性反应并不一致。

改良株系RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和RGD7S-5对该菌株表现抗病, 而其中一个株系RGD7S-1以及原始的GD-7S均表现感病。

进一步利用该菌株对受体GD-7S、供体BL122以及供体的遗传背景材料CO39接种鉴定, 结果发现GD-7S表现感病, 有趣的是BL122和CO39均表现抗病, 这说明CO39本身就含有对菌株00-148a的抗性基因, 以其为背景育成的BL122除含有Pi-1和Pi-2外, 还可能含有这些抗性基因。

通过回交结合分子标记辅助选择获得的改良株系, 其遗传背景并未完全回复到受体亲本的遗传背景, 仍残留了部分供体亲本的片段, 且不同株系之间残留片段的大小与多少可能不同, 从而导致不同株系之间的抗性表现存在一定差异。

因此, 笔者推测4个改良株系对00-148a的抗性不是导入Pi-1与Pi-2引起的, 而是供体遗传背景中其他稻瘟病抗性位点的导入产生的。

3.3分子标记辅助选择与抗病育种
分子标记辅助选择一个重要前提是分子标记必须与目标基因紧密连锁, 它们之间的遗传距离决定了分子标记辅助选择的准确率, 遗传距离越小准确率越高。

本研究采用的分子标记RM144与Pi-1距离6.8 cM, 距离相对较远。

陈志伟等[19]发展了一个距离Pi-1仅1.3 cM的SSR标记MGR4766, 并认为利用MGR4766对Pi-1进行选择的准确率可达到98%~100%。

本研究选用单个特异鉴别菌株对分离群体接种, 从中选择100个表现典型感病的单株进行标记检测, RM144准确率高达95%, 利用MGR4766进行检测, 结果与RM144完全一致。

尽管MGR4766和RM144与 Pi-1之间所报道的遗传距离差异较大,
第7期柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合Pi-1和Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性1135
但根据水稻基因组的物理图谱, 推测MGR4766和RM144与 Pi-1之间物理距离分别仅为57 kb和10 kb[19], 如此近的距离使两个分子标记与目标基因间的重组率均非常低, 从而保证了分子标记辅助选择的准确性。

目前利用分子标记辅助选择改良水稻白叶枯病抗性已有大量的研究报道[20-21], 而改良稻瘟病的报道很少。

王忠华等[22]设计了基于Pi-ta基因序列的功能分子标记, 但是该基因对我国稻瘟病菌株不具备广谱抗性[16]。

陈学伟等[23]利用农艺性状优良的G46B 与地谷、BL-1、Pi4号3个分别含抗病基因Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2的稻瘟病材料进行聚合杂交, 并利用分子标记辅助选择在F2代及BC1代群体获得了含抗病基因的植株。

Hittalmani等[24]以RFLP标记为基础通过MAS 对水稻稻瘟病抗性基因Pi-1、Piz-5和Pi-ta 进行累积。

这些研究主要是侧重于分子标记的开发和抗性基因的累加。

本研究通过1次杂交、4次回交和多次自交获得5个高抗稻瘟病改良不育株系, 在农艺性状与配合力方面与原始不育系基本相似, 使分子标记辅助选择真正与抗病育种相结合, 解决了传统育种实践难以解决的问题。

4结论
获得5个带有抗性基因Pi-1和Pi-2的纯合改良不育株系, 比原始GD-7S稻瘟病抗性大幅度提高, 所配杂种F1的稻瘟病抗性也显著提高; 改良株系的雄性不育起点温度与原始不育系基本一致, 农艺性状和配合力方面也基本相似。

致谢：本研究部分实验是在农业部水稻遗传改良重点开放实验室暨广东省水稻育种新技术重点实验室完成的, 并得到实验室研究人员的帮助, 谨致谢意。

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