甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的mmachc基因突变分析

甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的
MMACHC基因突变分析
摘要
研究背景
甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）又被称为甲基丙二酸尿症（methylmalonicaciduria），是氨基酸与有机酸代谢异常疾病中最常见的一种，是支链氨基酸代谢途径异常，属于常染色体隐性遗传性有机酸血症性疾病。

MMA主要由于甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷及其辅酶-5’脱氧腺苷钴胺素（维生素B12）（Ado-Cbl）合成代谢障碍，导致甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等异常蓄积，造成多个脏器功能受到损伤，尤其是神经系统的损伤。

Ado-Cbl代谢异常包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG、cblH 8个亚型，其中cblC最常见。

cblC病患者可以显示出广泛的临床表现，跨越了产前阶段到成年后期。

而同型半胱氨酸浓度增加和甲基代谢障碍可能有助于疾病相关的并发症，黄斑和视网膜变性的特点，并且每个不同个体发病时的临床表现各不相同：嗜睡、反复呕吐、喂养困难、肌张力低下、低体温、呼吸窘迫，惊厥反复发作或惊厥持续状态、严重的酮症酸中毒，高氨血症，高乳酸血症，肝功能损失、肾脏损失，眼科异常、皮肤异常、巨幼红细胞性贫血、中性粒细胞减少和血小板减少，脑水肿、脑出血，严重时可导致死亡。

cblC病的致病基因为MMACHC基因，该基因位于1号染色p34编码区域，编码cblC蛋白，功能是在细胞胞浆内催化还原脱氰反应和合成腺苷钴胺素反应。

当其发生基因突变时，编码cblC的蛋白不能够发挥其正常的生理功能，从而导致疾病发生。

本文中3例甲基丙二酸血症根据其典型的临床症状、生化特征进行总结，对疾病能够早期发现，早期明确诊断，并进行有效的治疗，改善患者预后提供
帮助。

同时，积极对其先证者及父母进行基因检测，了解先证者疾病发生的遗传方式（自身基因突变或遗传自父母），并对其提供相应的遗传咨询信息，在新生儿疾病筛查的早期检测，并仔细评估cblC病治疗方法，为该类疾病患者提供新的改善预后的机会，产前进行诊断可减少该类遗传性疾病的发生，补充相关基因的突变信息，完善MMACHC基因突变类型。

目的
1．总结来自3个家系，共3例MMA患者的临床症状、生化特征、治疗效果；
2．研究MMA患者发病的分子遗传学方式，明确诊断，了解MMACHC基因突变所发生的情况，推断其相关性，为患者提供遗传咨询及产前诊断。

方法
1．收集来自3个家系，共3例MMA患者的住院情况包括临床症状、生化特征、治疗效果；
2．样本采集：在研究对象签署送检同意书的情况下，采集研究对象及父母、50例正常健康体检患者晨起空腹的外周静脉血液各5ml；
3．基因组 DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取提取血液样中的基因组DNA；
4．引物设计：根据人类基因组数据库中设计MMACHC基因序列的引物，采用聚合酶链反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）法扩增目的基因，5．产物回收：采用PCR产物回收试剂盒进行产物回收；
6．上机测序：对PCR产物直接进行DNA测序，在人类基因组数据库GenBank中原始的基因序列进行对比并分析，获得基因突变位点。

结果
1．PCR扩增产物与预计扩增片段长度大致一致，无非特异性扩增片段，可进型步进行纯化和测序；
2．家系1中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第3外显子c.394C>T的杂合无义突变，第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变。

父亲第3外显子c.394C>T杂合无义突变；母亲第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变；
3．家系2中先证者MMACHC 基因发现：第4外显子 c.609G>A的纯合无义变异。

受检者其父母均为第4外显子 c.609G>A杂合无义突变；
4．家系3中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第1外显子c.80A>G的杂合错义突变，第4外显子c.609G>A的杂合无义突变。

父亲第1外显子c.80A>G杂合错义突变；母亲第4外显子c.609G>A杂合无义突变。

结论
1．收集的3个家系中先证者均符合MMACHC的临床及生化特征，诊断明确，早期临床干预治疗，预后均有明显改善；
2．家系1中先证者的分子遗传学基础是c.394C>T和c.656_658del复合杂合突变的组合，经查询基因库，c.656_658del变异的致病性尚未见文献报道，高度怀疑是1个新的遗传突变。

父母再次妊娠时可以行遗传咨询并对胎儿进行基因测序来根据结果做出产前诊断；
3．家系2和家系3中先证者的分子遗传学基础c.609G>A纯合突变、c.80A>G 及c.609G>A复合杂合突变的基因突变位点均已报道过，存在致病性，与既往报道一致。

关键词：甲基丙二酸血症，同型半胱氨酸血症，基因突变
Mutational analysis of MMACHC gene in cohorts of
patients with CblC type methylmalonicacidemia
Abstract
Research background
Methylmalonic acidemia (methylmalonicacidemia, MMA) is also known as methylmalonic aciduria (methylmalonicaciduria), is one of the most common diseases of amino acid and organic acid metabolism abnormal, is a branched chain amino acid metabolism pathway, is an autosomal recessive inherited disease of organic acidemias. MMA is mainly due to two methyl coenzyme A (methylmalonyl coenzyme A, MMCoA) mutase (methylmalonyl-CoA mutase, MCM) defect and coenzyme -5 'deoxyadenosyl cobalamin (vitamin B12) (Ado-Cbl) synthesis lead to metabolic disorders, methylmalonic acid, propionic acid and methylcitrate abnormal accumulation, causing multiple organ function by injury, especially the nervous system damage. Ado-Cbl metabolic abnormalities include cblA, cblB, cblC, cblD, cblE, cblF, cblG, and cblH 8 subtypes, among which cblC is the most common.
Patients with cblC disease can exhibit a wide range of clinical manifestations, spanning the prenatal stage to the late adulthood. Increased homocysteine concentration and methyl metabolism may contribute to disease related complications, characteristics of macular and retinal degeneration, and different clinical manifestations at the onset of each individual is different: lethargy, repeated vomiting, feeding difficulties, hypotonia, low body temperature, respiratory distress, recurrent seizures or status epilepticus severe ketoacidosis, lactic acidosis, hyperammonemia, liver function, kidney damage loss, eye abnormalities, skin abnormalities, megaloblastic anemia, neutropenia and thrombocytopenia, cerebral edema, cerebral hemorrhage, severe cases can lead to death.
The pathogenic gene of cblC disease MMACHC gene, the gene is located on chromosome 1 p34 encoding region, encoding cblC protein, function of catalytic reduction reaction and cyanide removal of deoxyadenosylcobalamin synthesis reaction in the cytoplasm. When a gene mutation occurs, the protein that encodes cblC fails to function properly and leads to disease.
In this paper, 3 cases of methylmalonic acidemia were summarized according to its typical clinical symptoms, biochemical characteristics, the disease can be found early, early diagnosis and effective treatment, help to improve the prognosis of patients. At the same time, the first positive permit and parental genetic testing, genetic methods of understanding disease (genetic mutation or genetic parents), and provide information for genetic counseling, reduce the genetic diseases, gene mutation of related information, improve the MMACHC gene mutation type.
Objective
1．The clinical symptoms, biochemical features and treatment effects of 3 patients with MMA from 3 families were summarized；
2．to study the pathogenesis of MMA in patients with molecular genetics, a clear diagnosis, understanding of the occurrence of MMACHC mutations, to infer the relevance of genetic counseling and prenatal diagnosis.
Method
1．A total of 3 patients with MMA from 3 families were included in the study, including clinical symptoms, biochemical characteristics, and treatment outcomes;
2．sample collection: the research object for consent signed in the case of collecting the research object and the parents, 50 healthy patients with fasting blood 5ml;
3．Genomic DNA extraction: genomic DNA extraction kit was used to extract genomic DNA from blood samples;
4．Primer design: according to the human genome database design MMACHC gene sequence primers, polymerase chain reaction (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplification of the target gene;
5．Product recovery: PCR product recycling kit for product recovery;
6．sequencing: the PCR products were directly sequenced by DNA, and the original gene sequences in the human genome database GenBank were compared and analyzed.
Result
1．the product of PCR amplification was approximately the same as the length of the amplified fragment, and it was no longer the specific amplified fragment;
2．Among the 1 probands of pedigrees, the MMACHC gene found a heterozygous heterozygous nucleotide mutation: third heterozygous heterozygous mutations in exon c.394C>T, and a heterozygous mutation in deletion of the nucleotide sequence of exon fourth of c.656_658del. Heterozygous mutations in the exon third of the father c.394C>T heterozygous nonsense mutation and deletion of the c.656_658del nucleotide sequence of the mother's fourth exon;
3．In pedigree 2, proband MMACHC gene found: fourth exon c.609G>A homozygous null mutation. The parents of the subjects were fourth exon c.609G>A heterozygous null mutations;
4．Among the 3 probands of pedigrees, the MMACHC gene found a heterozygous heterozygous nucleotide variant: first heterozygous missense mutations in exon c.80A>G, and heterozygous nonsense mutations in exon fourth of c.609G>A. Heterozygous missense mutation in father first exon c.80A>G; heterozygous mutation in mother fourth exon c.609G>A.
Conclusion
1．Among the 3 families, the proband was consistent with the clinical and biochemical characteristics of MMACHC. The diagnosis was clear and the prognosis was improved by early clinical intervention;
2．The molecular genetic basis for 1 families in the proband is a combination of c.394C>T and c.656_658del compound heterozygous mutations, the query gene pool, pathogenic c.656_658del mutation has not been reported, 1 new genetic mutations suspected. Parents can have genetic counseling when they are pregnant again, and gene sequencing of the fetus is used to make pre production diagnosis based on the results;
3．The molecular genetic basis of pedigree 2 and pedigree 3 probands, c.609G>A homozygous mutations, and c.80A>G and c.609G>A heterozygous heterozygous mutation loci have been reported, and their pathogenicity is consistent with previous reports.
Key words：Acidemia, Homocysteine, Gene Mutation
目录
正文部分
中英文缩略词表 (I)
甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的MMACHC基因突变分析 (1)
1 引言 (1)
2 对象和方法 (4)
3 结果 (10)
4 讨论 (11)
5 结论 (14)
参考文献 (15)
附图 (18)
综述部分
甲基丙二酸血症研究进展 (22)
参考文献 (40)
附录部分
个人简历、在学期间发表的论文 (46)
致谢 (47)
中英文缩略词表
英文缩写英文全称中文全称
MMA methylmalonicacidemia 甲基丙二酸血症
HCY Homocysteinemia 同型半胱氨酸血症
A 甲基丙二酰辅酶A MMCoA methylmalonyl
coenzyme
mutase 甲基丙二酰辅酶A变位酶MCM methylmalonyl-CoA
CBL cobalamin 钴胺素
CblA mitochondrial Cbl reductase 线粒体钴胺素还原酶CblB mitochodrial cobalamin adenosyltransferase 线粒体钴胺素腺苷转移酶BCAA branch chain amino acid 支链氨基酸
BCKA branch chain ketotic acid 支链酮酸
triphosphate 5’-三磷酸腺苷
ATP adenosine
FMN flavin mononucleotide 黄素单核苷酸
FAD flavin adenine dinucleotide 黄素腺嘌呤二核苷酸MSR methionine synthase reductase 蛋氨酸合成酶还原酶SAM S-adenosyl methionine S-腺苷甲硫氨酸
甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的
MMACHC基因突变分析
研究生：李婉婉
导师：罗强教授
河南郑州 450003
1 引言
甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）又称甲基丙二酸尿症（methylmalonicaciduria）是氨基酸与有机酸代谢异常中最常见的病种,常染色体隐性遗传性疾病。

氨基酸代谢病是由于酶的缺陷导致正常的代谢途径发生障碍，进而引起生化反应的异常，导致组织或体液内环境中氨基酸异常堆积，引起相应的组织器官功能障碍，并出现相对应的各种临床症状。

先天性氨基酸、有机酸代谢异常患者出生时一般无临床表现，经数日的哺乳后因生化反应过程中酶的缺陷导致代谢途径阻滞，即可出现受累的氨基酸异常蓄积，血中此种氨基酸水平明显增高，继续增高超过肾阈值时，出现氨基酸有机酸尿现象。

另外，由于正常的氨基酸代谢途径出现障碍，堆积的氨基酸将由其他的代谢途径进行代谢，并导致其旁路的代谢分解产物也异常增多，可由尿液中排出体外。

测定血液和尿液中异常增多的氨基酸或尿液中明显增多的代谢产物，可做出明确诊断。

生化反应的改变逐渐引起临床症状的表现，并造成组织器官的功能损失，故早期检测氨基酸及代谢产物，可以在组织器官功能受到损失及临床症候表现前给予明确的诊断，并根据诊断进行对症及有效的治疗，可预防其临床症状的出现，避免不可逆转的不良后果。

MMA主要由于甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl coenzyme A,MMCoA）变位酶（methylmalonyl-CoA mutase,MCM）缺陷及其辅酶-5’脱氧腺苷钴胺素（维生素B12）（Ado-Cbl）合成代谢障碍，导致甲基丙二酸、丙酸和甲基枸橼酸等异常蓄积，造成多个脏器功能受到损伤，尤其是神经系统的损伤。

Ado-Cbl代谢异
常包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG、cblH 8个亚型，其中cblC 最常见。

MMA患病率在不同国家和地区存在着很大的差异[1]，美国为1：48000；意大利为1：61775，德国为l：169000，日本为1：50 000，我国台湾地区约为1：85000。

维生素B12是一个重要的辅因子,它参与硫、支链氨基酸、奇数链脂肪酸和胆固醇代谢。

甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症即cblC病，是细胞内维生素B12代谢异常引起，属常染色体隐性遗传，致病基因为MMACHC基因[2]，该基因位于1号染色p34编码区域，全长总共约10.8kb，编码一个包括了282个氨基酸的cblC蛋白，该cblC蛋白的功能是在细胞胞浆内催化还原脱氰反应和合成腺苷钴胺素反应。

当MMACHC基因发生基因突变时，编码cblC的蛋白不能够发挥其正常的生理功能，从而导致疾病发生。

该病病理生理学尚不完全清楚，目前同型半胱氨酸浓度增加、甲基代谢受损、氧化应激3个病理因素导致疾病的发生及并发症的产生[3.4]。

目前为止[5]，国内外共有250种不同的基因突变类型，不同的国家和民族MMACHC基因突变的位点有差异性，如c.331c > T突变多于法国、加拿大国家患者多见；c.394c > T突变常见在亚洲的印度/巴基斯坦/中东地区。

欧美国家cblC病患者最常见的突变类型是c. 271 dupA[6]，其中Lemer.EHis 等[7]通过对366例cblC病患儿基因分析发现了60个突变位点，c.271dupA突变率高达占42%，该位点纯合突变的患儿均发病较早。

Augoustides Savvopoulou等人的报道[8]，2姐妹基因检测分析：确诊甲基丙二酸血症，存在 c.271dupa和c.394C >T复合杂合突变，姐姐在新生儿期即有癫痫发作，发育延迟，逐渐进展为痉挛性截瘫，，死亡于13岁。

妹妹9岁以前无临床表现，之后逐渐出现生长迟缓、癫痫发作。

在相同的突变位点中出现早发型和迟发型2中不同的情况，存在显著的家庭内表型的异质性。

MMA患者的临床表现是异质的，复杂多样的，易造成误诊，并且每个不同个体发病时的临床表现各不相同，最常见的症状和体征是嗜睡、生长障碍、反复呕吐、脱水、呼吸困难及肌张力低下。

根据维生素B12负荷试验结果，分为VitB12有效型和无效型，即连续3天肌肉内注射VitB12 1mg/d，若症状好转，生化异常改善，则为VitB12有效型。

VitB12有效型：多为cblC、cblD、cblF型，cblA、cblB型部分有效。

其中cblC型患儿最常见。

主要表现为巨幼红细胞性贫血、生长障碍即神经系统症状。

其中早发型多于1岁内起病，迟发型多在4岁以后出
现症状，可合并多系统损伤[9-10]。

cblD型患儿发病较晚，无血液系统异常表现。

cblF型患儿新生儿期出现口腔炎、肌张力低下和面部畸形，部分有血细胞形态异常[10-11]。

VitB12无效型：是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由于变位酶缺陷引起。

出生时可无临床表现，迅速进展为嗜睡、呕吐并有脱水，继而出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下并发脑病[9,12]。

Mut0型患儿比其他类型更早出现症状，尤其是神经系统损伤， 80%出生第一周发病，且症状较严重，预后较差[10,,12]。

此外，也有报道一些无症状的“良性”甲基丙二酸血症患者，尿中甲基丙二酸排泄轻度增加，其长期预后以及临床表现型还有待进一步研究[13]。

cblC病的治疗原则是减少代谢毒物的生成及加速其清除，目前临床上以药物治疗为主[14]：1.维生素B12：增加突变蛋白酶的亲和力，有利于反应中所需辅酶的合成；2.甜菜碱：甲基供体存在，同型半胱氨酸蛋氨酸通过甜菜碱提供甲基合成半胱氨酸甲基转移酶，绕过甲基钴胺素依赖蛋氨酸合酶途径；3.左旋肉碱：有利于丙酸的排泄和防止肉碱缺乏症。

为了进一步了解MMA疾病的分子遗传学基础，总结其临床特征、生化特点、了解其MMACHC基因的突变位点情况，本文收集了3个家系中3列先证者及其父母的静脉血液，进一步明确基因诊断及遗传方式，完善MMACHC基因突变库。

MMACHC基因的变异性可以方便产前和cblC病的早期诊断，通过扩大新生儿筛查，提高cblC病的生存质量。

2 对象和方法
2.1 研究对象
研究对象来自3个家系，共3例（均为散发），患者临床症状、生化、辅助检测及基因检测均支持甲基丙二酸血症的诊断，并收集患者及父母及来自我院100名健康体健对照者的静脉血，采血前均征得所有受试者及监护人同意。

家系1 先证者，女，3月，因“反复呕吐、喂养困难”入院，自出生后反复呕吐、喂养困难，生长发育落后（出生时体重3Kg，3月龄时体重3.9Kg，较标准体重低12%），智力发育落后（3月龄儿不追物、对外界声音及光刺激反应较差、四肢肌张力低下、眼神转动不灵活）。

院外查头颅CT示：1.两侧额、顶叶局部脑白质密度减低，2.两侧额、颞、顶叶脑外间隙增宽。

一般检查、肝肾功能、粪常规、叶酸、维生素B12检查未见异常。

患儿父母体健，非近亲结婚。

患儿系G1P1、足月、剖产，无窒息、感染、产伤史，患儿母孕期间体健，未服用特殊药物，无放射性物质接触史，家族中无类似病史。

多次血常规：HB：95-105g/L （正常范围110-160g/L），MCV：98-103fl, （正常范围82-95fl）。

乳酸5.4mmol /L↑（正常值＜4 mmol/L），血氨50µmol/L（正常对照20-60μmol/L）尿液中同型半胱氨酸25.4 umol/L（正常对照＜5umol/L），血浆同型半胱氨酸161.17umol/L（正常对照4-10umol/L）。

GC-MS分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。

LC-MS/MS分析血液中Gln：Cit，Glu：Cit，C3，C3/C0,C3/C2增高，Met，Met/Phe，C0降低，诊断为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症。

家系2 先证者，男，2月，因“嗜睡、精神差”入院，自出生后出现嗜睡、吃奶无力、四肢肌张力低下，抽搐（表现：强直发作、2-3次/天）。

其母第一胎时因同样的表现于6月龄时死亡。

头颅MRI示：右侧额颞部硬网膜积液，蛛网膜下腔隙增宽。

EEG：右枕、右颞、右额减慢波散在发放。

一般检查、肝肾功能、叶酸、维生素B12检查未见异常。

尿液中同型半胱氨酸28 umol/L，血浆同型半胱氨酸187umol/L，GC-MS分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。

LC-MS/MS分析血液中C3，C3/C0,C3/C2增高，Met，Met/Phe 降低。

家系3 先证者，男，2岁，因“反应差、发育迟滞”入院，2岁龄行走不稳，反应差，与人交流差不会说话。

一般检查、肝肾功能、叶酸、维生素B12检查未见异常。

G1P1、足月、剖产，家族中无类似病史。

多次血常规：HB：85 -100g/L （正常范围110-160g/L），MCV：100-105fl, （正常范围82-95fl）尿液中同型半胱氨酸23 umol/L，血浆同型半胱氨酸98umol/L（正常对照4-10umol/L）。

GC-MS 分析尿液中甲基丙二酸增高，同时发现乳酸和甲基枸橼酸也增高。

LC-MS/MS 分析血液中，C3，C3/C0,C3/C2增高，Met降低。

2.2 实验材料
2.2.1 主要试剂及试剂盒
DNA提取试剂盒上海生工生物工程股份有限公司
PCR扩增试剂盒上海生工生物工程股份有限公司
DNA Marker 上海生工生物工程股份有限公司
琼脂糖西班牙Biowest公司
PCR产物回收试剂盒上海生工生物工程股份有限公司
2.2.2 主要仪器
普通冰箱海尔公司
-20℃冰箱海尔公司
普通台式离心机美国SIGMA公司
紫外分光光度计美国STARTORIUSG公司
PCR扩增仪美国BIO-BAD公司
凝胶成像系统美国St公司
电子分析天平日本SHIMADZU公司
2.3 方法
2.3.1 血浆标本的留取
患者及辅酶空腹血液标本于EDTA抗凝管中，离心后取上层血浆500µl至-80℃超低温冰箱保存。

2.3.2 外周血白细胞DNA提取
采用1ml血液基因组DNA提取试剂盒对标本进行提取外周血基因组DNA，步骤如下：
（1）将冻存血置于37℃恒温振荡器中150rpm复融，充分混匀至没有血凝块；
（2）取750µl FG1 Buffer到1.5ml的离心管中，再加300µl全血并来回颠倒离心管5次，充分混匀（如果血样难溶解，SBP混匀仪混匀10min）；
（3）10,000rpm离心20s；
（4）倒掉上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上2min；
（5）加入150µl的FG2/QIAGEN蛋白酶Buffer，盖上离心管，混合至颗粒完全溶解；
（6）将离心管低速离心3-5s，65℃温育5min；
（7）加入100%异丙醇150µl，SBP混匀仪颠倒混匀；
（8）10,000rpm离心3min；
（9）倒掉上清液，短暂倒置离心管在干净的吸水纸上；
（10）加入70%乙醇150µl，漩涡混合5s；
（11）10,000 rpm离心3min；
（12）倒掉上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上（至少5min）；
（13）重复步骤9.10.11一到两次；
（14）风干DNA颗粒，直到所有液体蒸发（至少5min）；
（15）加入200µl FG3 Buffer，低速漩涡混匀5s，65℃温育 1h；
（16）经Nanodrop定量后，存放-20℃备。

以上操作均在冰上进行。

（注：提取血液中基因组时，加入各试剂的比例如表1、表2）
表1 BufferFG2/蛋白酶配制
体积（ul）
BufferFG2 10 QIAGEN蛋白酶 0.1
表2 提取正常血液中基因组时，加入各试剂的比例
全血体积（ul）全血体积（ml）
试剂（ul） 200
300 400 500 试剂（ml） 1
2
3
4 BufferFG1 500
750 1000 1250 BufferFG1 2.5 5.0 7.5 10.0
BufferFG2/蛋白酶 100 150 200 250 BufferFG2/蛋白酶0.5 1.0 1.5 2.0
异丙醇 100
150 200 250 异丙醇 0.5
1.0
1.5
2.0 70%乙醇 100
150 200 250 70%乙醇 0.5
1.0
1.5
2.0 0.4BufferFG3 200
200 200 250 0.4BufferFG3 0.2 0.2 0.3 0.4
2.3.3 NDA质量检测
（1）取5ul基因组DNA置于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，检测基因组DNA片
段的位置和亮度。

（2）DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml
双链DNA、40 μg/ml单链DNA。

OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时
不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影
响光吸收值，但并不表示纯度低。

2.3.4 PCR扩增
（1）扩增MMACHC基因4个外显子片段的引物序列由上海生工生物技术
有限公司设计合成。

F：forward primer（正向引物），R：reverse primer（反向引
物）。

引物序列如表3。

表3 扩增MMACHC基因外显子序列的引物序列及扩增片段的长度
外显子引物序列产物大小（bp）
1 2 3 4 F：5'-GGGATCAATATGGTCTACGC- 3'
R：5'-GAACCCACATACCCTACTGCG -3'
F：5'-TCATGACATAGTGCTGAGGA -3'
R：5'- TCACAGGGTTAGGGCCTCGC-3'
F：5'-GACAGGACCATGTTCACACACA-3'
R：5'-AGGGAGAGGCCTTTACCAGTCT-3'
F：5'-CACCCAGAAAACCTCATGACTG-3'
R：5'-ACCACCATAAATCAGGGTCCAC-3'
554
465
565
643
（2）配制25ul反应体系，如表4。

表4 PCR扩增：25ul反应体系
试剂组分体积（µl）
H2O 4 2*GC Buffer І 12.5
dNTP 4 LA Tap 0.5
Primer 2 DNA 2 （3）PCR反应条件：94℃预热变性3min，接着94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min共30个循环，后接着72℃终延伸5min。

2.3.5 PCR扩增结果
（1）溶解曲线：扩增反应完成后，通过逐渐上升温度同时监测每一步的荧
光信号产生溶解曲线，扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰可以将特异性产物与其它产物区分开。

（2）每份标本的PCR反应扩增产物各取5ul加在1%的含EB琼脂糖凝胶相
邻加样孔上电泳，电压为80v，电流为60ms左右，时间约20-30分钟。

在紫外
投射仪下观察结果。

2.3.6 PCR产物的纯化
酒精/EDTA/NaAc法(25µL体系)：
（1）每管加入2 µL 125 mM EDTA，2 µL 3 M NaAc，加到管底；
（2）加入50 µL 100% 酒精，转移至1.5mL EP管，14000g 离心3min；
（3）倒立EP管于吸水纸，甩干；
（4）加入70 µL 70% 酒精，14000g 离心3min；
（5）倒立EP管于吸水纸，甩干；
（6）重复70% 酒精洗涤1次；
（7）让残余的酒精挥发干，加入1０µL Hi-Di甲酰胺，震荡溶解。

2.3.7 PCR产物测序
将PCR产物委托北京康旭生物公司采用ABI-PRISM3730测序仪器进行测序。

2.3.8 测序结果分析
读取测序峰图，将MMACHC基因的测序结果与GenBank中的原始序列进行对比分析。

3 结果
3.1 PCR扩增反应
PCR扩增产物与预计扩增片段长度大致一致，无非特异性扩增片段，可进型步进行纯化和测序。

3.2 扩增产物ＤＮA的直接测序
本文中3个家系中3名先证者，均为散发，3名先证者及其各自父母的MMACHC基因突变位点结果如下：
家系1中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第3外显子c.394C>T（编码区第 394 号核苷酸由C变为T）的杂合无义突变，第4外显子c.656_658del（编码区第656_658号核苷酸缺失）核苷酸序列缺失的杂合突变。

父亲第3外显子c.394C>T杂合无义突变；母亲第4外显子c.656_658del核苷酸序列缺失的杂合突变；
家系2中先证者MMACHC 基因发现：第4外显子 c.609G>A（编码区第 609 号核苷酸由 G 变为A）的纯合无义变异。

受检者其父母均为第4外显子c.609G>A杂合无义突变；
家系3中先证者MMACHC 基因发现复合杂合核苷酸变异：第1外显子c.80A>G（编码区第 80 号核苷酸由A变为G）的杂合错义突变，第4外显子c.609G>A（编码区第609 号核苷酸由G变为A）的杂合无义突变。

父亲第1外显子c.80A>G杂合错义突变；母亲第4外显子c.609G>A杂合无义突变。

4 讨论
维生素B12为含钴的维生素，正常人每日需要量为1ug，主要由动物性食物提供，肠道微生物亦能合成少量，其在体内因结合基团不同，有多种形式存在，如氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素，后两者是维生素B12的活化形型，也是血液中存在的主要形式。

药用维生素B12必须在体内转化为活性形式才能被组织所利用。

维生素B12是细胞分裂和维持神经组织髓鞘完整所必需。

B12主要参加下列代谢过程：1、同型半胱氨酸甲基化生成蛋氨酸反应，催化这一反应的蛋氨酸合成酶（或称甲基转移酶）的辅基为维生素B12，它参与甲基的转移。

B12缺乏时，导致蛋氨酸生成受阻，同时影响四氢叶酸的再循环，影响嘌呤、嘧啶的合成，最终导致核酸合成障碍，产生巨幼红细胞性贫血。

因此B12缺乏会同时引起叶酸缺乏症和同型半胱氨酸（堆积）血症。

2、5-脱氧腺苷钴胺素是L-甲基丙乙酰CoA变位酶的辅酶，催化L-甲基丙乙酰CoA转化为琥珀酰CoA，进入三羧酸循环。

当B12缺乏时L-甲基丙乙酰CoA大量堆积，影响脂肪酸的正常合成，从而影响髓鞘转化，髓鞘退化，进行性脱髓鞘。

本研究中的3例先证者均得到明确诊断，给予甲钴胺注射液肌肉注射，后给予甜菜碱、左旋肉碱治疗，临床症状明显改善，实验室指标趋向正常，总结如下：
1、家系1先证者给予肌肉注射甲钴胺后呕吐症状好转，饮食可，四肢肌张力渐好转，生长发育及智力发育渐趋向同龄正常儿童。

治疗后多次测尿液中同型半胱氨酸2-4 umol/L（正常对照＜5umol/L），血浆同型半胱氨酸33-43umol/L，虽偏高，但较治疗前明显下降（正常对照4-10umol/L）。

GC-MS分析尿液中甲基丙二酸、甲基枸橼酸均正常范围。

LC-MS/MS分析血液中C3，C3/C0,C3/C2均降至正常范围。

2、家系2先证者精神症状明显好转，给予抗癫痫药物治疗癫痫发作部分控制，由2-3次/天较少至3-4天发作1次，甚至间隔时间更长。

实验室检查指标均趋向正常范围。

3、家系3先证者生长发育逐渐趋向正常同龄正常儿童，实验室检查指标均趋向正常范围。