基因功能的研究方法课件ppt

一、计算机预测基因功能
➢ 计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序 。同源基因可以分为2类：
➢ 种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之
前的同一祖先。 ➢ 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种
关键问题。 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综合性，区分其准确的功能更加棘手。
2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA Ⅲ类：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。
✓ 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 已经完成基因组测序的多细胞生物基因注解时遇到的最大困难是，如何鉴别外显子以及可变剪切的类型。
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或
其新功能，研究发育生物学
➢ 深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命
各期的表现，可以得到详细的有关该基因 在生长发育中的作用，为研究基因的功能 和生物效应提供模式。
➢ 例如，目前人类基因组研究多由新基因序
列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在 小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。 目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、 LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种基 因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。 这已在不少实验中得到证实。
高等真核细胞内外源DNA与靶细上。
2 基因敲除的技术路线如下：
自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点 ：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
二、实验确认基因功能
➢ 同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。
如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。
大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。
生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的 不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形
成之后，也可能出现于物种形成之前。 ➢ 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因
为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但
它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸
位置是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从
③ 治疗遗传病；
④ 改造生物、培育新的生物品种。
ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术 的成熟，首次使体外精细的基因操作与小 鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接 的结合，为探讨高等动物基因组结构和功 能提供了有效的方法。
由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对 哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学 、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类 遗传学产生了极大影响。
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
➢ 同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。
➢ 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
2．转座子突变库构建
转座子标签法又称基因标签(gene tagging) ，通过构建插入突变库系统，分离与克隆 功能基因与调控顺序。这一策略主要依据 以下技术：
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
➢ 通过上述种种方法得到的携带失活基因的品系与
个体后，下一步工作就是检测突变体表型以便指 认未知基因的具体功能。这一步也会遇到难题， 生物表型范畴很广。
➢ 即使单细胞的酵母，要确认一个未知基因对表型
的贡献，也可列出很长的一串名单。
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综
合性，区分其准确的功能更加棘手。
➢ 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。
传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型
。因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标 基因相关的表型。
1．基因失活是功能分析的主要手段
➢ 传统的遗传分析主要借助突变型研究表型 变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学 试剂处理可使生物群体产生突变个体，也 可从自然的群体中发现突变体。
➢ 有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。
➢ 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
Hirashima等1986年发现，针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的反义RNA，要比单纯对编码区域能会出现序列偏性现象。
分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来 4 人工合成构建反义RNA
这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类。 改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能；
➢转座子可以发生回复突变，从插入的座位
脱离，使突变系重现野生型表型。
➢目前应用的最成功的是玉米的Ac-Ds转座因
子系统。基因标签突变库的工作原理如下 ：
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制
5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )
5.3 反义RNA的功能
调控细菌基因的表达 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 IS10转位作用的抑制
➢ 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这 一突变体是否与改变的表型对应。在此基 础上采用分子生物学方法进一步分离与克 隆目标基因。
➢ 所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的 分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。
➢ 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设 计从基因到表型的研究。如果我们能找到 某种方法，根据待测基因的顺序使生物体 内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型 变异。
③ 用选择培养基筛选已击中的细胞；
④ 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转 基因动物，对转基因动物进行形态观 察及分子生物学检测。
Note:
基因敲 ✓除的基应用因领域主敲要有：除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细 胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于 Ⅱ类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源 重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的 ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年 中，基因敲除技术得到了进一步的发展和 完善。
1.2 基因敲除的技术路线如下：
① 构建重组基因载体；
② 用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA转入受体细胞核内；
图2 酵母双杂交系统的实验基本过程
这已在不少学实验的中得到C证实a。pecchi教授的研究组发展的"正负双向
选择系统"适用范围宽且效率较高。
1.3 基因敲除主要应用领域及国内外研究 进展
基因敲除的应用领域主要有：
① 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学 研究提供材料；
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功 能；
是一件非常困难的能会出现序列偏性现象。
研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。
筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的 3 基因敲除主要应用领域及国内外研究进展
1 反义RNA的分类和作用机制 同源基因都有1个共同的祖先基因，他们之间有许多相似的顺序。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
基因功能的研究方 法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质
一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如 大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前 已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。
大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES 细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟 的基础上开展其它实验动物的基因敲除工 作。
① 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学
研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分 子基础及诊断治疗的重要实验材料。如 1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（ CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立了 CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为 CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以 顺利通过了基因治疗的动物试验；于1993 年开始临床试验并获得成功。
③ 治疗遗传病
这包括去除多余基因或修饰改造原有异 常基因以达到治疗的目的。
③ 改造生物、培育新的生物品种
细菌的基因工程技术是本世纪分子生物 学史上的一个重大突破，而基因敲除技 术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃 。这项新技术在基础理论研究及实际应 用中都将有着广阔的应用前景。
1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初 ，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养 的成功奠定了基因敲除的技术基础。