第五章 酶的提取及纯化1

2、固体剂型 直接浓缩干燥、喷雾干燥、沉淀后干燥； 便于运输和短期保存，成本也不高。
3、纯酶制剂

包括结晶酶在内，一般用作分析测试试剂或用作药 物，要求有较高纯度。
4、固定化酶制剂
二、酶的稳定性与保存
1、影响酶稳定性的因素 温度 pH 酶蛋白的浓度 底物浓度 氧 酶液中的蛋白酶
第五章
酶的提取及纯化
酶提取纯化方法
● 1 酶液获得 ● 2 沉淀、萃取方法 ● 3 柱层析分离法 ● 4 电泳
重点掌握：酶液制备的方法、从酶液中提取 酶的方法、酶的制剂化
酶提取纯化总原则 防止酶的变性失活

低温 合适的pH 避免激烈搅拌，减少泡沫 去除重金属、微生物、蛋白酶等
一、酶液的制备
离子强度和类型对盐析的影响
几种蛋白质析出时所需硫酸铵的 离子的强度
蛋白质在不同电解质中的盐析效应
离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响 较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱
pH对盐析的影响
盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。
但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。需根 据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞
细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理
固液分离
酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
●
干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill) 湿式：
●
均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,

4，复合沉淀

在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉 淀，分离出沉淀后，再用适当的方法将酶从复合物 中重新析出。
5，双水相萃取
Polymer-Polymerwater-protein system
Polymer-Salt-waterprotein system
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
双水相萃取

反相胶团萃取
1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响： ● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶 解 度
2
pI
[NaCl]
0.005M 0.02M
pH > 5.2
0.01M

几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ (NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4 70.6 4.9 1.6 20℃ 75.4 18.9 7.8 80℃ 95.3 43.3 93.8 100 ℃ 103 42.2 101

2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
有机溶剂沉淀
离子强度对有机溶剂沉淀的影响

离子强度是影响溶质在有机溶剂及水混合液中溶解 度的一个重要因素，盐的浓度大小或太大都对分离 有不利影响，对于蛋白质，在有机溶剂中盐的浓度 不超过5%比较合适，使用的乙醇量也以不超过二倍 体积为宜。
有机溶剂沉淀
3，等电沉淀
■ 环 境 影 响 分 子 的 帶 电 性 质
2、稳定酶的方法 添加底物、抑制剂或辅酶； 添加SH-保护剂。如谷胱甘肽、DDT、二巯基乙醇、 EDTA； 添加蛋白质； 添加低分子的无机离子； 添加蛋白酶抑制剂。

等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的酶蛋白，而 对于亲水性很强的酶蛋白，由于在水中溶解度较大， 在等电点的pH下不易产生沉淀。所以，等电点沉淀 法不如盐析沉淀法应用广泛。但该法仍不失为有效 的蛋白质初级分离手段。 与盐析法相比，等电点沉淀的优点是无需后继的脱 盐操作。但是，如果沉淀操作的pH过低。容易引起 酶蛋白的变性。
原 理
有机溶剂的沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数，溶液的介电常数
减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加从而使溶解度减少。
Organic Solvent Precipitation:
+
Membrane protein
Solvent %
+
-
+
-
+
-
-
-+
-
-
+
+ +
+
+
Water-soluble protein
盐析用中性盐的选择

常用的中性盐 MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4 选择中性盐应注意的问题

使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而 本身又易去除。
对酶无毒性，应用不受影响。



价格低廉。
废水处理容易。
常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他 常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这 是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是 在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～ 4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度， 远远高于其它盐类：
+
-
-
+
-
有 機 溶 劑
+
-
+
-
-+
+ +
+
-
+
溶 解 度
- +
+ +
+
-
+
-
+
+ + +
-
+
-
-+
-
-
+ +
+
-
+
-+ -
+
-
2，有机溶剂沉淀
优 点
分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在 一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 在生化制备中应用比盐析法广泛
+ +
+
+
+ +
+
溶 解 度
KCl
- +- += + - + - + NaCl -+ ++- += - +
-+ - +- + -+- + + - + -+ + - + + - - ++ + + - +-+ +-+- + -+ - - + + +
+
-
- +- + + -
-
Salting-out:
A little salting-in effect
Environmental pH
11 10 9 Isoelectric point, 8 pI 7 6 5 4 3
+
0
-
Net Charge of a Protein
■ 等电点与环境 pH 的关系：
环 境
pH = 6 pI = 5
等电点
0 0 0
凝 聚
环 境
pH = 4
+
+
+
• 等电点沉淀法主要利用酶 蛋白分子上的电中性时溶 解度最低，而各种酶蛋白 具有不同等电点而进行分 离的一种方法。 • 酶在处于等电点时的pH值， 再加上其他沉淀因素，则 很易沉淀析出。
+ +
+
-
NH SO
+ 4
+
溶 解 度
Ammonium sulfate
-
24
+
Sodium sulfate
+
+
蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入时， 这些水分子被抽出，以便盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域 相互结合，形成沉淀。
+ +
-
-
+
-
-
-
Ionic strength
-
温度对盐析的影响
温度升高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。 在一般情况下，蛋白质的盐析温度要求不严格，可以在室温下进行，只有某些对温度比较敏 感的酶，要求在低温0-4 ℃下操作。以避免活力的丧失。
2，有机溶剂沉淀
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。


4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法

盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素

蛋白质浓度
离子强度和类型
玻璃球 (glass bead), 超声波震荡, French press
一、酶液的制备
4、发酵液的预处理
预处理的目的 改善发酵液的过滤性能，使其更易过滤， 获得澄清的酶液。 预处理的方法
加热
凝聚（Coagulation）和絮凝（Flocculation）
助滤剂
一、酶液的制备
5、固液分离 过滤 离心 沉降 膜过滤



温度 酶蛋白的浓度 pH 金属离子 离子强度
有机溶剂沉淀
温度对有机溶剂沉淀的影响

酶蛋白质在有机溶剂中对温度反应特别敏感，温度 稍高即发生变性。因此，加入的有机溶剂都必须预 冷至较低温度，操作要在冰浴中进行，同时加入有 机溶剂必须缓慢而又不断搅拌以免溶剂局部过浓。
温度的高低会影响到已沉淀的蛋白质复溶。
1
0.001M
pH = 5.2
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
0.001 Salting-in
0.01
0.1
pH
NaCl concentration (M)
Salting-in:
NaCl
Ionic strength
分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入 盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
有机溶剂沉淀


pH值对有机溶剂沉淀的影响

在酶结构稳定范围下选择溶解度最低处的pH值，有 利于提高沉淀效果。
适宜的pH值可大大提高分离的分辨能力。

有机溶剂沉淀
金属离子对有机溶剂沉淀的影响

一些多价离子如Zn2+和Ca2+在一定的pH值下能与呈阴 离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中 或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响酶蛋 白的活性。
一、酶液的制备
6，酶液浓缩 酶液浓缩的作用

减少盐析剂、有机溶剂用量 减少压滤后的废水量，从而减轻其对周围环境 的污染 真空浓缩（刮板薄膜蒸发器、降膜式蒸发器、 升膜式蒸发器） 冰冻浓缩 超滤浓缩

酶液浓缩的方法


二、酶的提取

盐析沉淀 有机溶剂沉淀 等电点沉淀
复合沉淀
6，反相胶团萃取
蛋白质溶解于小水池中，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接 触而失活。改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相，实现了蛋白质的萃取分离、纯化目的。
7，色谱柱分离

离子交换色谱
亲和色谱 疏水色谱 凝胶色谱
第二节 酶的剂型与保存
一、剂型 1、液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液； 比较经济、但不稳定，而且成分繁杂。
pH
温度
蛋白质的浓度与盐析的关系


利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋 白质实际浓度有很大关系。 LogC1＝β-KsI1 这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。 但如 果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为C2)， 则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。 (设此时离子强度为I2)应写作： LogC2＝ β-KsI2 Log（C1/C2）＝Ks（I2-I1）
+
-
-
-
Aggregate
+
+
-
+
+
定义：在酶或蛋白质溶液中加入 中性盐使其沉淀析出的过程

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盐 析

机 理 破坏酶蛋白质分子表面水膜 中和酶蛋白质分子表面电荷
盐析法的优点 • 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 • 操作简单，安全。 • 对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析法的缺点 • 沉淀物中含有大量的盐析剂
有机溶剂沉淀
有机溶剂添加量的确定

有机溶剂添加量多少合适需通过实验来确定。
对各种酶的加量大致如下：

过滤澄清的枯草杆菌淀粉酶或蛋白酶发酵液，每体积添加 0.2~0.8体积的有机溶剂， 中性蛋白酶，加0.8~1.1体积；

碱性蛋白酶，加1.1~1.4体积。
有机溶剂沉淀
有机溶剂沉淀的影响因素

有机溶剂沉淀
酶蛋白浓度对有机溶剂沉淀的影响

低浓度样品使用有机溶剂的量大但共沉作用小，利 于提高分离的效果；
高浓度样品可以节省有机溶剂，减少变性危险，但 共沉作用大，分离效果较差。 一般认为蛋白质最初浓度为5~20毫克/毫升范围较为 合适，再加上选择适当的pH值，进行分段沉淀。即 可获得较好的结果。
缺
点
容易引起酶变性失活，操作常需在低温下进行。
常用的有机溶剂


乙醇 甲醇 丙酮 异丙醇
有机溶剂沉淀
有机溶剂的选择

有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶 剂的种类而异。对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂沉淀 能力，依次为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。这个顺 序还受温度、pH、盐离子浓度的影响。丙酮沉淀能 力最强，但挥发损失多，价格相对较高，工业上一 般采用乙醇。