短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶A2的分离纯化及磷酸化修饰检测

第１９卷第３期２０２０年５月
杭州师范大学学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｎｇｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．１９Ｎｏ．３
Ｍａｙ
２０２０收稿日期：２０１９ ０６ １０ 修回日期：２０１９ ０７ ２０
基金项目：国家大学生创新训练项目（２０１７１０３４６１００８）；浙江省自然科学基金项目（ＬＹ１４Ｃ０３０００７）．
通信作者：高建芳（１９８２—），男，副研究员，博士，主要从事爬行动物进化生态学和生理生化研究．Ｅ ｍａｉｌ：ｇａｏｊ
ｆ３０８＠１６３．ｃｏｍ犱狅犻：１０．１２１９１／ｊ
．ｉｓｓｎ．１６７４ ２３２Ｘ．２０２０．０３．０１２短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶犃２的分离纯化
及磷酸化修饰检测
罗亚军，林楚霞，文　琳，汪　妍，徐　宁，高建芳
（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州３１１１２１
）摘　要：利用阴离子层析、凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱从短尾蝮蛇毒中分离金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２，
用蛋白印迹法检测两种组分的磷酸化修饰信号，结合ＬＣ ＭＳ质谱鉴定并预测磷酸化修饰位点．结果表明，利用３种色谱法串联组合，最终分离获得两种条带单一且纯度高的短尾蝮蛇毒蛋白，经ＬＣ ＭＳ质谱鉴定分别为蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２．免疫印迹检测发现这两种蛇毒蛋白受到明显的磷酸化修饰，解析质谱图发现蛇毒金属蛋白酶有４个氨基酸位点受到潜在的磷酸化修饰（含１个丝氨酸和３个苏氨酸），磷脂酶Ａ２仅有１个酪氨酸位点受到潜在的修饰．所得结果是磷酸化位点修饰抗体在蛇毒蛋白磷酸化修饰信号检测中的一次尝试，基于修饰位点的预测可为蛇毒蛋白功能受磷酸化修饰影响的研究提供基础．
关键词：短尾蝮；纯化；蛇毒；金属蛋白酶；磷脂酶Ａ２；磷酸化中图分类号：Ｑ９５６ 文献标志码：Ａ文章编号：１６７４ ２３２Ｘ（２０２０）０３ ０２９０ ０７
翻译后修饰（如糖基化、磷酸化、乙酰化）是驱动蛇毒组分及功能多样化的重要因素［１ ３］
．
迄今为止，有关蛇毒蛋白翻译后修饰的研究，主要局限于利用特异性显色剂对修饰类型的表象检测上，也有部分研究对
少量的修饰蛋白进行了质谱鉴定［４ １１
］．此外，还有一例研究报道了美洲矛头蝮（犅狅狋犺狉狅狆狊犼犪狉犪狉犪犮犪）蛇毒全蛋白组水平的糖基化修饰强度，并预测了修饰位点［３］．
少量研究工作报道了翻译后修饰对蛇毒功能的影响，如从美洲矛头蝮中分离出的一种具有纤维蛋白原水解活性的丝氨酸蛋白酶（ＢＰＡ）中，Ｎ端糖苷占到总分子质量的６２％；
当局部去除糖基化修饰，发现其纤维蛋白原水解活性大为增强，且丝氨酸蛋白酶抑制剂也无法再抑制其活性，显然这种特性受到了聚糖结构的影响［１０］．对美洲矛头蝮和铜头蝮（犃犵
犽犻狊狋狉狅犱狅狀犮狅狀狋狅狉狋狉犻狓犾犪狋犻犮犻狀犮狋狌狊）蛇毒出血金属蛋白酶Ｊａｒａｒｈａｇｉｎ和ＡＣＬＨ去翻译后修饰处理或直接原核表达的研究发现，这两类物质与其天然形式相比，出血活性消失，仅保留纤维蛋白原和纤连蛋白水解活性，这种去修
饰后组分在临床抗凝药物开发上显然具有潜在的价值［１１］．
但由于缺少足够的关于蛇毒组分翻译后修饰的表征，限制了翻译后修饰对蛇毒组分功能影响的研究．
本研究以短尾蝮（犌犾狅狔犱犻狌狊犫狉犲狏犻犮犪狌犱狌狊）蛇毒为对象，利用阴离子层析、凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱从中分离纯化金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２，
利用三位点磷酸化修饰抗体检测两种组分的磷酸化修饰信
号，结合ＬＣ ＭＳ质谱鉴定并预测磷酸化修饰位点．通过位点修饰抗体在短尾蝮蛇毒蛋白磷酸化修饰信号检测中的实践，
为蛇毒全蛋白组水平的磷酸化修饰研究提供参考，并为特定氨基酸位点的磷酸基团在蛇毒组分功能多样性变化中的作用研究奠定基础．
１　材料与方法
１．１　蛇毒采集
实验用短尾蝮成体采自浙江萧山，用咬膜皿法采集蛇毒，新鲜毒液经１００００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ后吸取上清，随后用Ｌａｂｃｏｎｃｏ４．５Ｌ冷冻干燥机（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）制备成蛇毒冻干粉，并保存于－８０℃备用．１．２　蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶犃２分离纯化称取０．３ｇ蛇毒冻干粉，用２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０缓冲液溶解，并用０．２２μｍ针头滤器过滤．随后将过滤液上样至ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱（１６／１０）进行阴离子层析分离，设置流速２ｍＬ／ｍｉｎ，用ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ低压液相层析系统按以下步骤进行洗脱：２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０洗脱５个柱体积，０～０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０）线性梯度洗脱３０个柱体积，０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌｐＨ８．０）洗脱５个柱体积，收集各组分峰．取５０ｍｇ含目的组分的ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱分离峰溶于５０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ（含０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌｐＨ７．０），随后上样至ＳｅｐｈａｒｃｙＳ ２００ＨＲ柱（ＨｉＰｒｅｐ１６／６０）进行凝胶排阻色谱分离，设置流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ，用５０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ（含０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌｐＨ７．０）缓冲液洗脱２个柱体积，收集各组分峰．各组分峰经超滤管（３ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）除盐浓缩后冷冻干燥，－２０℃保存备用．
取１ｍｇ含金属蛋白酶的凝胶排阻分离峰样品，溶于含０．１％三氟乙酸（ＴＦＡ）的超纯水，１００００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ，取上清．将上清上样至Ｋｒｏｍａｓｉｌ３００Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）
，设置流速１ｍＬ／ｍｉｎ，用ＷａｔｅｒｓＥ６００高效液相系统进行分离．流动相分别为０．１％ＴＦＡ和乙腈，设置线性梯度洗脱条件为：含１０％乙腈的ＴＦＡ洗脱１０ｍｉｎ，含２５％乙腈的ＴＦＡ洗脱１０ｍｉｎ，含４５％乙腈的ＴＦＡ洗脱
４５ｍｉｎ，６０％乙腈５０ｍｉｎ．磷脂酶Ａ２的线性梯度洗脱条件设置为：含１０％乙腈的ＴＦＡ洗脱１０ｍｉｎ，含２５％乙腈的ＴＦＡ洗脱１０ｍｉｎ，含３５％乙腈的ＴＦＡ洗脱５０ｍｉｎ．所有组分峰收集后冷冻干燥，－２０℃保
存备用．
测定各组分峰蛋白浓度时，将其用超纯水溶解后以Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定稀释液浓度［１
２］
，每个样品重复测定３次，以牛血清白蛋白作为标准品．利用各阶段收集峰的蛋白含量与上样蛋白含量的比值作为组分峰的相对含量，以各收集峰总的蛋白含量与上样蛋白含量的比值计算单次分离的得率．
１．３　蛋白酶水解活性和磷脂酶犃２活性检测
用含２％牛乳酪蛋白的０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ为底物检测蛇毒金属蛋白酶水解活性［１３］
，将阴离子层析或凝胶排阻色谱所得的不同蛇毒组分峰蛋白（４０μｇ
）加入０．５ｍＬ底物液，于３７℃水浴反应２ｈ．加入等体积０．４４ｍｏｌ／Ｌ三氯乙酸溶液终止反应，随后５０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ取上清．将上清和０．４ｍｏｌ／ＬＮａＣＯ３以２
∶５混合，后加入１份福林酚再次充分混匀，在６６０ｎｍ下读取吸光值．蛋白酶水解活性以每分钟每毫克蛇毒蛋白降解底物引起吸光度改变０．０１作为一个酶活性单位（Ｕ／（ｍｉｎ·ｍｇ
））．以大豆卵磷脂为底物检测磷脂酶Ａ２活性［１３
］，将阴离子层析或凝胶排阻色谱所得的不同蛇毒组分峰蛋白（０．８μｇ）加入２００μＬ底物体系（０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，７ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｔｏｎＸ １００，０．３５％大豆卵磷脂和９８．８ｍｍｏｌ／Ｌ酚红，ｐＨ７．６），混合均匀后，在室温静置观测１ｍｉｎ，以颜色由浅紫色迅速变为黄色作为蛇毒组分是否具有较强的磷脂酶Ａ２活性的判断标准．
１．４　犛犇犛 犘犃犌犈和狑犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测
各收集峰蛇毒蛋白的ＳＤＳ ＰＡＧＥ分离及与磷酸化抗体间的ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测方法参照Ｇａｏ等［１４］
．蛇毒蛋白定量上样后用１２％分离胶在Ｂｉｏ ＲａｄＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＩＩＩ电泳系统分离．电泳结束后，用半干转印仪将胶上蛋白转印至ＰＶＤＦ膜（０．４５μｍ）上，随后用含５％ＢＳＡ的ＴＢＳＴ缓冲液在４℃中封闭过夜．
封闭１
９２　第３期罗亚军，等：短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２的分离纯化及磷酸化修饰检测
完成后，ＰＶＤＦ膜用ＴＢＳＴ缓冲液漂洗３次，随后将膜转移至小鼠抗Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｔｙｒ三位点磷酸化修饰一抗（１∶１０００稀释）中，３７℃摇床孵育１ｈ．孵育结束后，ＰＶＤＦ膜用ＴＢＳＴ缓冲液漂洗３次，随后将膜放入ＨＲＰ标记的兔抗鼠二抗（１∶３０００稀释）中，３７℃摇床再次孵育１ｈ．用ＴＢＳＴ彻底洗去膜上未结合的二抗，并控干ＰＶＤＦ膜上的残留液．最后用ＥＣＬ发光显色试剂盒对ＰＶＤＦ膜进行连续曝光显色，经曝光的Ｘ光片控干后用Ｕｍａｘ２１００扫描仪扫描，随后用Ｔａｎ４１００软件分析结果．１．５　质谱鉴定及磷酸化修饰位点预测
从ＳＤＳ ＰＡＧＥ胶上切下目的蛋白条带，用超纯水清洗３次后用枪头捣碎．加入２０ｎｇ／μＬ胰蛋白酶液４０μＬ，３７℃孵育１６ｈ．将酶解液上样至Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ Ｃ１８ｐｅｐｔｉｄｅｔｒａｐ
ｓ柱，并经ＣｏｌｕｍｎＲＰ Ｃ１８柱（１５０ｍｍ×０．１５ｍｍ）进行毛细管高效液相分离．以０．１％甲酸水溶液为流动相Ａ液，以含８４％乙腈的０．１％甲酸水溶液为流动相Ｂ液，设置线性梯度洗脱条件为：４％～５０％Ｂ液３５ｍｉｎ，５０％～１００％Ｂ液１５ｍｉｎ，１００％Ｂ液５ｍｉｎ．分离产物用ＱＥｘａｃｔｉｖｅ质谱仪进行鉴定，选择正离子检测方式，采集４５ｍｉｎ数据，
每次全扫后采集１０个二级质谱图用于分析多肽碎片的质荷比．质谱结果用ＰｅａｋｓＸ搜索引擎在实验室自有亚洲蝮属（犌犾狅狔犱犻狌狊）毒蛇毒腺转录组翻译后蛋白库中进行配对检索．一级质谱和二级质谱质量容差分别设置为２０ｐｐｍ和０．１Ｄａ，允许最大遗漏酶切位点为１个，设置Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）为固定修饰，Ａｃｅｔｙｌ（Ｎ ｔｅｒｍ）、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）和Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ
ｌａｔｉｏｎ（Ｓ／Ｔ／Ｙ）为可变修饰，设定肽段得分阈值为１５．２　结果与分析
短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２的分离及活性检测结果见图１
、图２
．Ａ：ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子层析；Ｂ：Ｓｅｐｈａｒｃｙ
２００凝胶排阻色谱；Ｃ：Ｃ１８柱反相高效液相色谱分离蛇毒金属蛋白酶；Ｄ：Ｃ１８柱反相高效液相色谱分离蛇毒磷脂酶Ａ２．图１　三步法分离短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶犃２
犉犻犵．１　犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狊狀犪犽犲狏犲狀狅犿犿犲狋犪犾犾狅狆
狉狅狋犲犻狀犪狊犲犪狀犱犘犔犃２犳狉狅犿犮狉狌犱犲狏犲狀狅犿狅犳犌．犫狉犲狏犻犮犪狌犱狌狊狌狊犻狀犵犪狋犺狉犲犲 狊狋犲狆犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狆
狉狅狋狅犮狅犾２
９２杭州师范大学学报（自然科学版）
２０２０年　
Ａ：ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子层析；Ｂ：Ｓｅｐｈａｒｃｙ
２００凝胶排阻色谱．图２　短尾蝮蛇毒各组分峰蛋白酶水解活性
犉犻犵．２　犘狉狅狋犲狅犾狔狋犻犮犪犮狋犻狏犻狋狔狅
犳犳狉犪犮狋犻狅狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿狏犲狀狅犿狅犳犌．犫狉犲狏犻犮犪狌犱狌
狊Ａ：蛇毒蛋白ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳；Ｂ：
磷酸化修饰抗体；ａ：蛇毒金属蛋白酶；ｂ：磷脂酶Ａ２．图３　犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测磷酸化修饰抗体与蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶犃２的免疫反应
犉犻犵．３　犆狉狅狊狊 狉犲犪犮狋犻狅狀犫犲狋狑犲犲狀犪狀狋犻 狆犺狅狊狆犺狅 犛犲狉／犜犺狉／犜狔狉犪狀狋犻犫狅犱狔
犪狀犱狊狀犪犽犲狏犲狀狅犿犿犲狋犪犾犾狅狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犪狀犱犘犔犃２犫狔狑
犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋短尾蝮粗毒经ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子层析共分离获得８个组分峰，２、３、４和７号峰蛇毒蛋白能明显水解酪蛋白，且３号峰的水解能力最强（图１Ａ、图２Ａ），达到６．６Ｕ／ｍｇ，预示该组分峰具有较高的蛇毒金属蛋白酶含量．３号峰组分在１ｍｉｎ内能将含酚红的大豆卵磷脂底物液由浅紫色迅速变为黄色，表明该组分峰还具有较强的磷脂酶Ａ２活性．３号峰经Ｓｅｐｈａｒｃｙ ２００凝胶排阻色谱进一步分离，共收集７个组分峰，６、７两个峰回收后得率较低，未用于后续活性分析，其余５个组分峰中只有１、２两个峰能有效降解酪蛋
白，且２号峰水解能力相对较高，达到８．７Ｕ／ｍｇ（图１Ｂ、图２Ｂ），表明该峰可能具有较高的蛇毒金属蛋白酶含量．凝胶排阻色谱所得７个峰中，仅５号峰组分在１ｍｉｎ内能将含酚红的大豆卵磷脂底物液由浅紫色迅速变为黄色，表明该组分峰还具有较强的磷脂酶Ａ２活性．反相高效液相分离结果显示，２、５两个峰仍具有多个复杂的组分峰（图１Ｃ、Ｄ），其中两个主要的组分峰ａ和ｂ经ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测为单一条带，分子质量分别为６６和１６ｋＤａ（图３Ａ）．
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定粗毒蛋白及各组分峰含量显示，分离用短尾蝮粗毒含蛋白５５％，单次阴离子层析所得８个峰的最终得率为粗毒蛋白的８２．３％，３号峰含蛋白１０．３％．凝胶排阻色谱所得的２号峰和５号峰，分别占上样蛋白的３０．０％和１１．９％；反相高效液相分离所得的ａ和ｂ两个峰，分别占上样蛋白的４４．３％和４７．３％，这两个峰分别占粗毒总蛋白的１．４％和０．６％．
蛋白免疫印迹检测显示，最终分离所得ａ和ｂ两个峰的蛇毒蛋白能被三位点（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）磷酸化修饰抗体有效识别，呈现出明显的磷酸化修饰信号，且ａ峰所含蛋白条带的信号更为强烈（图３Ｂ）．质谱检测结果显示，ａ峰所含组分为蛇毒金属蛋白酶，共匹配到１２条特征性肽段，且肽段集中在活性结构域；并从４条肽段中预测到４个氨基酸磷酸化修饰位点，分别为
１个丝氨酸和３个苏氨酸（表１）．ｂ峰所含组分为磷脂酶Ａ２，共匹配到２２条特征性肽段，该组分属于Ｄ４９型磷脂酶Ａ２；
仅从１条肽段中预测到１个酪氨酸磷酸化修饰位点（表１）．３
９２　第３期罗亚军，等：短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２的分离纯化及磷酸化修饰检测
表１　短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶犃２磷酸化修饰鉴定
犜犪犫．１　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犿狅犱犻犳犻犮犪狋犻狅狀犻狀犿犲狋犪犾犾狅狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犪狀犱犘犔犃２犳狉狅犿狏犲狀狅犿狅犳犌．犫狉犲狏犻犮犪狌犱狌狊组分峰分子质量／ｋＤａ质荷比电荷数 肽段（磷酸化修饰）得分
蛇毒蛋白／自建库编号
ａ
６８
５９４．７７８１．０６４３．８４３５．７５７２．３７０７．８７７１．９６７６．３５３９．８６６０．４６４１．６
６９３．９
２３２２２２２２２２４２ＡＹＶＡＳＭＣＱＱＤ
ＡＹＶＡＳＭＣＱＱＤＳＳＶＧＩＮＱＤＨＳＫＤＳＳＶＧＩＮＱＤＨＳＫＨＫＤＤＬＤＫＩＲＴ（ｐｈ）ＲＩＹＥＩＱＤＳＳＶＧＩＮＱＤＨＳＫＱＱＤＳＳＶＧＩＮＱＤＨＳＫＳ（ｐｈ）ＨＤＡＡＨＬＬＴ（ｐｈ）ＮＩＳＨＤＡＡＨＬＬＴＮＳＨＤＡＡＨＬＬＴＮＩＫ
Ｔ（ｐｈ）ＲＩＹＥＩＶＮＴＭＮＥＭＦＩＰＬＮＩＲＶＡＬＶＳＬＥＩＷＳＮＲ５７．１３２．９２５．８２０．９１６．１１６．９３４．７１９．１４６．７８１．１１８．１３２．０
Ｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＧＢＶ｜ｃ４１２２１＿ｇ１ｂ
１６
４０４．７４６２．２６３９．８４９９．２５７９．２５１８．７６１８．３６８２．３４４１．２４９１．２４４９．２６４６．８７１０．８４３８．７５６０．７６２４．８６９４．８５５５．２７６７．８４８２．８５６８．２３８８．７
２２２２２２２２２２２２２２２２２２２２２２
ＡＡＡＩＣＦＲＡＡＡＩＣＦＲＤＡＡＡＩＣＦＲＤＮＬＫＣＣＦＶＨＤＣＣＣＦＶＨＤＣＣＣＧＧＤＤＰＣＫＫＤＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＤＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＫＤＮＬＫＴＹＫＥＩＣＥＣＤＲＦＥＴＬＩＭＫＧＤＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＧＤＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＫＧＧＤＤＰＣＫＫＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＫＩＹ（ｐｈ）ＭＡＹＰＤＩＦＣＫＥＩＣＥＣＤＲ
ＮＧＤＩＶＣＧＧＤＤＰＣＫＫＲＡＡＡＩＣＦＲＶＣＧＧＤＤＰＣＫＫＶＴＧＣＤＰＫ
１２２．７７３．９９０．８５１．９７１．８９１．３４１．９１０４．８４８．３７３．０１９．３１０２．２１１６．１１６．１２８．８９１．９１６．７９５．２６３．９２９．２３２．４８０．５
ＰＬＡ２；ＧＵＵ｜ｃ２９６５７＿ｇ２３　讨论
一般认为，磷酸化和糖基化修饰对维持蛇毒蛋白的结构稳定性、生物活性和免疫原性具有重要作用，
对于阻断猎物体内含有的生理抑制剂以便毒蛇捕食、消化猎物同样具有不可忽视的作用［３］
．
此外，这些修饰对于蛇毒中具有药用活性的组分参与细胞增殖分化及凋亡、
骨架调控、肌肉收缩和神经递质合成与释放、肿瘤的发生与浸润扩散也具有重要的影响．理论上，这些修饰可以通过ｃＤＮＡ序列进行预测，但对于特定修饰类型的强度和复杂性（
如修饰位点、功能和结构域等），仅依靠对概念性翻译的预测是无法获得相４
９２杭州师范大学学报（自然科学版）
２０２０年　
对准确的信息的，且还容易因ｃＤＮＡ序列预测所得的修饰位点数量过多，干扰后续基于位点修饰前后蛇毒蛋白功能变化的研究．利用特异性荧光染料（如Ｐｒｏ ＱＤｉａｍｏｎｄ）
可实现对磷酸化修饰蛇毒蛋白的识别［
２
］，但染料无法实现对修饰蛋白肽段的捕获，因此无法用于高通量筛选鉴定蛇毒蛋白的磷酸化修饰全组．近年来发展的以抗磷酸化修饰抗体亲和捕获待检样品中的磷酸化修饰肽段及高精度检测技术，能在样品鉴定前进行富集处理，便利了样品蛋白质修饰组学研究，已在大肠杆菌组氨酸磷酸化修饰研究中取得了
良好的效果［１５］
．
本研究利用三步法分离纯化短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２，结合蛇毒活性检测和质谱鉴定验证两种组分．考虑到阴离子层析和凝胶排阻色谱分离阶段各组分峰仍可能存在多个蛋白条带，故以酪蛋白和大豆卵磷脂水解活性用于初步判断，并选择活性最高组分峰用于后续分离．当然，两种底物水解活性并非是蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２的唯一判定标准．质谱解析所得组分峰ａ的肽段主要对应于自建库短尾蝮蛇毒金属蛋白酶的水解活性结构域，但该组分表观分子质量为６８ｋＤａ，符合ＩＩＩ型蛇毒金属蛋白酶的分子质量特点，理论上应能鉴定到除活性结构域之外的去整合素和半胱氨酸富集区，有可能是该区域在质谱检测中未能捕获到对应的母离子．蛇毒磷脂酶Ａ２匹配到的特征性肽段相对较多，因其特征性肽段“ＣＣＦＶＨＤＣＣ”中含有天冬氨酸，故属于Ｄ４９型磷脂酶Ａ２．
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果发现两种分离组分的显色强度存在较大差异，除了因分子质量不同所致的转膜效率差异外，还可能是由于金属蛋白酶具有较多的磷酸化修饰位点导致其能结合更多的磷酸化修饰抗体．以往有关亚洲蝮属蛇岛蝮（犌犾狅狔
犱犻狌狊狊犺犲犱犪狅犲狀狊犻狊）蛇毒的研究利用质谱鉴定了５条可被Ｐｒｏ ＱＤｉａ ｍｏｎｄ染色的蛋白，
但仅能预测到１个磷酸化修饰位点［８］
，位点预测的有效性不高．利用三位点磷酸化修饰抗体可有效检测短尾蝮蛇毒分离组分受到的修饰强度，
加之选择了亚洲蝮属毒腺转录组作为自建库用于质谱峰图解析，保证了位点预测的有效性．当前检测也表明，三位点磷酸化修饰抗体完全可用于亲和捕获短尾蝮蛇毒磷酸化修饰组分，
进行修饰组学鉴定．本研究的结果证实了三位点磷酸化修饰抗体能有效识别短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２，并成功预测了氨基酸修饰位点，为磷酸化修饰抗体用于高通量鉴定蛇毒蛋白磷酸化修饰全组提供了可行性参考，也为研究磷酸化修饰在蛇毒蛋白功能多样性变化中的作用奠定了基础．
参考文献：
［１］ＢＩＲＲＥＬＬＧＷ，ＥＡＲＬＳ，ＭＡＳＣＩＰＰ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｖｅｎｏｍｆｒｏｍｔｈｅＡｕｓｔｒａｌｉａｎｂｒｏｗｎｓｎａｋｅ，犘狊犲狌犱狅狀犪犼
犪狋犲狓狋犻犾犻狊［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６，５（２）：３７９ ３８９．
［２］ＢＩＲＲＥＬＬＧＷ，ＥＡＲＬＳＴＨ，ＷＡＬＬＩＳＴＰ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏ
ｆｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＡｕｓｔｒａｌｉａｎｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
，２００７，６（６）：９７３ ９８６．［３］ＺＥＬＡＮＩＳＡ，ＳＥＲＲＡＮＯＳＭＴ，ＲＥＩＮＨＯＬＤＶＮ．犖 ｇｌｙｃｏｍｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆ犅狅狋犺狉狅狆狊犼
犪狉犪狉犪犮犪ｎｅｗｂｏｒｎａｎｄａｄｕｌｔｖｅｎｏｍｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２，７５（３）：７７４ ７８２．
［４］ＮＡＷＡＲＡＫＪ，ＰＨＵＴＲＡＫＵＬＳ，ＣＨＥＮＳＴ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｅｃｔｉｎ ｂｏｕｎｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｆｒｏｍｔｈｅＥｌａｐｉｄａｅａｎｄＶｉｐ
ｅｒｉｄａｅｆａｍｉｌｉｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３（３）：３８３ ３９２．
［５］ＮＡＷＡＲＡＫＪ，ＳＩＮＣＨＡＩＫＵＬＳ，ＷＵＣＹ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｏｆｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｓｆｒｏｍＥｌａｐｉｄａｅａｎｄＶｉｐｅｒｉｄａｅｆａｍｉｌｉｅｓｂｙｍ
ｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ，２００３，２４（１６）：２８３８ ２８５４．［６］ＳＥＲＲＡＮＯＳＭＴ，ＳＨＡＮＮＯＮＪＤ，ＷＡＮＧＤＹ，ｅｔａｌ．Ａｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖｉｐｅｒｉｄｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｓｂｙｔ
ｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ａｎａｐｐｒｏａｃｈｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｖ
ｅｎｏｍｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５，５（２）：５０１ ５１０．［７］ＺＨＵＺＬ，ＬＩＡＮＧＺ，ＺＨＡＮＧＴＹ，ｅｔａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｗｏｇｌｙｃｏｓｙ
ｌａｔｅｄｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
，２００５，２８０（１１）：１０５２４ １０５２９．［８］刘淑清，孙明忠，赵宝昌．质谱法分析蛇毒蛋白翻译后修饰［Ｊ］．高等学校化学学报，２００８，２９（１１）：２１９４ ２２００．［９］张翠丽，刘淑清，孙明忠，等．白眉蝮蛇蛇毒糖基化蛋白的质谱分析［Ｊ］．大连医科大学学报，２００８，３０（３）：１９６ ２００．
［１０］ＰＡＥＳＬＥＭＥＡＦ，ＰＲＥＺＯＴＯＢＣ，ＹＡＭＡＳＨＩＲＯＥＴ，ｅｔａｌ．犅狅狋犺狉狅狆
狊ｐｒｏｔｅａｓｅＡ，ａｕｎｉｑｕｅｈｉｇｈｌｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ｉｓａｐｏｔｅｎｔ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃａｇ
ｅｎｔ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００８，６（８）：１３６３ １３７２．５
９２　第３期罗亚军，等：短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶Ａ２的分离纯化及磷酸化修饰检测
［１１］ＧＡＲＣ?ＡＬＴ，ＳＩＬＶＡＬＴＰ，ＲＡＭＯＳＯＨＰ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏ
ｆｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＣ，
２００４，１３８（１）：２３ ３２．［１２］ＢＲＡＤＦＯＲＤＭＭ．Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｅｂｉｎｄｉｎｇ
［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７２（１／２）：２４８ ２５４．［１３］ＧＡＯＪＦ，ＷＡＮＧＪ，ＨＥＹ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｓｈｏｒｔ ｔａｉｌｅｄｐｉｔｖｉｐｅｒ（犌犾狅狔
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ｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４，１０５：３０７ ３２２．［１４］ＧＡＯＪＦ，ＷＡＮＧＪ，ＱＵＹＦ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｂ
ｅｔｗｅｅｎｖｅｎｏｍｓａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｎｔｉｓｅｒｕｍｓｉｎｆｏｕｒＣｈｉｎｅｓｅｓｎａｋｅｓａｎｄｖｅｎｏｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０１３，３８７（１／２）：２１１ ２１８．［１５］ＫＥＥＪＭ，ＯＳＬＵＮＤＲＣ，ＰＥＲＬＭＡＮＤＨ，ｅｔａｌ．Ａｐａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｈｉｓｔｉｄｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙ
ｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ
，２０１３，９（７）：４１６ ４２１．犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犘犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犕狅犱犻犳犻犮犪狋犻狅狀犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犕犲狋犪犾犾狅狆
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（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨａｎｇｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇ
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（ＳｃｈｏｏｌｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，ＨａｎｇｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇ
ｚｈｏｕ３１１１２１，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｌｅｔ犐狀ｂｅｔｈｅｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｖｅｒｓｅｓｅｍｉｇｒｏｕｐｏｎａｆｉｎｉｔｅｓｅｔ犡狀＝｛１，２，…，狀｝．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｓｔｈｅｓｅｍｉｇｒｏｕｐ犗犈犡狀＝｛α∈犐狀｜ 狓，狔∈犱狅犿（α），狓≤狔 狓α≤狔αｗｈｉｌｅ｜狓－狔｜≤｜狓α－狔α｜｝∪｛ ｝ｏｆｐａｒｔｉａｌｏｎｅ ｔｏ ｏｎｅｏｒｄｅｒ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｅｘｔｅｎｓｉｏｎｆｉｎｉｔｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎ犡狀，ｐｒｏｖｅｓｔｈａｔ犗犈犡狀ｉｓａｎｏｎｒｅｇｕｌａｒｔｙｐｅ犃ｓｅｍｉｇｒｏｕｐ
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９２杭州师范大学学报（自然科学版）
２０２０年　。