最低检测限确定的方法

最低检测限确定的最佳方法
关于LOD和LOQ术语的定义，最常用的是1975年国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）所下的定义，它对LOD的定义是“检出限以浓度(或质量)表示，指由特定的分析方法能够合理地检测出并与统计学分析的空白背景能区分开的最低浓度(或质量)”。

这个术语虽然很直白，但也过于简单。

它有几个问题未回答，比如，统计分析的差别是什么意思？这里所指的“空白”，在分析中考虑了那些因素？留下这些因素由分析者自己判断，将会导致不同分析者给出的数据差别很大，从而失去数据间的比较意义。

LOD可分为两个部分，仪器检测限（instrumental detection limit,IDL）和方法检测限（method detection limit,MDL）。

仪器检测限（instrumental detection limit,IDL），可定义为在仪器上能稳定检出的与背景相区别的最小分析数量。

仪器的定量限（instrumental quantification limit,IQL），它可定义为用某一分析方法在仪器上能可靠的定量检出的最小数量。

这两条术语（IDL和IQL）只是定义了仪器的限量。

当我们分析诸如动植物组织或土壤、地下水等真实样品时，为了确定检测限，样品基质的干扰必须考虑。

这是因为真实样品基质中含有成百上千种各类化合物，这些化合物可能会以不同的方式干扰对目标药物的检测和定量。

方法检测限（method detection limit,MDL），这条术语适用于分析基质中某种成分的提取和测定方法。

MDL可定义为一种分析方法能稳定地从含基质的样品中检测出与背景相区别的（用一种特殊方法）最小数量。

当确定MDL时，所有基质中的干扰都必须考虑进来。

与此相似，方法定量限（method quantification limit,MQL）可定义为一种分析方法以某种稳定的方式从含基质的样品中（用一特殊方法）能定量检出的最小数量。

最后，定义方法确证最低水平（the lowest level of method validation,LLMV）也很重要。

LLMV可定义为在基质中用浓度表示的可分析出的最小数量，这里的方法（提取、分析程序）是指已被确证或证明能稳定定量检出的方法。

2.1IUPAC方法
1975年，IUPAC定义LOD的浓度为(c L)，由浓度为c L溶液产生的信号为x L，定义x L的值为空白信号的平均值x B加上这些空白信号的标准偏差(s B)。

公式表示如下：
这里k是一个常数，与所选择的置信水平相关。

Long和Winefordner进一步将c L与x L联系起来给出如下公式：
这里m被定义为分析的灵敏度，可用线性回归方程的斜率表示。

当我们把等式（1）中的x L代入等式（2）中，Long和Winefordner定义c L为：
Long和Winefordner及其他几位作者都赞成k=3,其允许的置信水平达到99.86%，如果x B的值低于正态分布，那么k=2也被一些工作者认可，其置信水平达到89%，相应的c L的置信水平也下降了。

在后来的1995年，IUPAC对LOD的定义进行了扩展，它包括了假阳性和假阴性概率。

IUPAC和美国化学学会（the American Chemical Society,ACS）双方都同意采纳等式（3）中c L的计算公式。

但这个定义对当今用于分析食品（土壤）和动物体液（组织）中的药物残留所用的自动色谱系统而言仍有几个问题有待解决。

2.2误差传递法(Propagation of errors method)
IUPAC法的一种变化形式叫做误差传递法(Propagation of errors method，PE)，该法已被Long和Winefordner探讨过。

在该方法中，LOD被定义为：
这里的i是截距，s
i 是截距的标准偏差，s
m
是斜率m的标准偏差。

如果s
m
的值很小，那么等式（4）可以简略为：
如果s
i
值远小于s B值，那么等式（5）也可简略为IUPAC定义中的等式（3）。

为了更精确地测定s
i
值和s m值，至少要做五条标准曲线来估算这两个值。

对动态测试系统如色谱法等，这将是一个繁琐和花费时间的过程。

另一方面，对诸如紫外/可见光、原子吸收、电感耦合等离子－质谱法等静
态系统而言，PE方法很方便使用，因为s
i
值和s B值很容易从多个未加标的控制
样品提取物中测得。

此外，PE法优于IUPAC法的主要原因在于其计算MDL时把误差包含在整个分析测试过程中。

2.4两步法（Two-step approach）(由美国环保局提出)
由美国环保局提出的确定水样品中LOD和LOQ的方法。

该法在由Roy-Keith Smith著的题为《环境分析手册》一书中也曾提到过。

另外，该法也包含在美国环保局提出的‘人类保健食品风险评估中，为未检出与未定量的农药残留赋值’之导则中。

这个方法在确定MDL和MQL时包括两步：
1)确定仪器的IDL和IQL并用它们的值估算MDL和MQL；
2)在农作物（化合物）的提取或分析方法中计算MDL和MQL。

在这个方法中，为了使计算MDL和MQL的值准确可靠，两步紧密结合十分重要。

如果只做了第一步，那么计算结果中基质影响和干扰这些因素就未计算进来，相反，如果只做第二步，那么用加标控制样品的浓度计算的标准偏差就会偏离MDL和MQL的值。

上面提到的几种方法都可用来计算IDL和IQL。

最简单估算MDL和MQL的方法就是测量保留时间附近的峰－峰噪声（Np-p），然后用三倍噪声信号所对应的浓度（基质分析中）估算MDL。

或者，分析者遵循以下方法来获得更可靠的MDL估算值：
1)分析几次（至少五次）未加标样品的提取物；
2)测量每次提取物的Np-p；
3)计算Np-p的平均值；
4)计算能产生三倍噪声信号所对应的溶液的浓度（要考虑提取、净化过
程中分析物的预计损失）
5)计算在基质分析中能产生那个信号（使用浓度与稀释因子）所对应的
数值来估算MDL的值。

2.5误差平均平方根方法（the root mean square error method,RMSE）
这是美国环保局推荐的另一种估算LOD的方法，用标准曲线和计算误差平方根来估算。

该方法适应于检测器与分析物浓度之间呈线性关系的分析类型。

RMSE方法包括如下步骤：
1)用标准品做4至5个点的标准曲线，标准品的浓度在一个数量级范围
内。

为此，检测限可估算为三倍噪声所对应的浓度，用检测器信号（x）
对应浓度（c）绘制标准曲线。

2)做出标准曲线的回归方程，计算出几个标准品（n）的斜率（m）、截距
（i）和相关系数r2。

3)标准曲线可用如下方程表示：
x=m·c+i (6)
4)依据斜率（m）和截距（i）计算每个标准品预计的对应信号值(x
)。

p
-x|
5)计算每次测量的误差（E）|x
p
6)计算每个标准品点的误差的平方，取这些点(n)的误差平方的总和（∑
E2）。

7)RMSE可按如下公式计算：
8)预计IDL(x L)的响应值可用如下公式计算：
x L＝i+(3·RMSE) (8)
9)重新编排公式(6)，IDL（CL）可用如下公式计算：
联合公式（8）、（9），我们可得到如下公式：
这里CL的值表示的是溶液的浓度，因为RMSE是由标准曲线算出的，所以未考虑基质的影响，因此，这个值反映的是IDL的值，这为下一步计算MDL的值打下良好的基础。

比较公式（10）和IUPAC定义的检测限（5），它们的不同是这里RMSE代替了SB。

对诸如自动积分色谱动态系统而言，相对SB来说RMSE更易计算也更可信，其理由前面已探讨过。

虽然两种计算不一样，但提供了相同的结果，这由计算SB和RMSE的公式可明显看出来。

LOQ被认为是精确定量计算的下限，有几位作者，像Miller和Miller、Skoog 和Leary及Smith等曾建议将LOQ定义为能产生相当于SB的10至12倍信号所对应的浓度。

这里如果标准偏差足够小（大约10－15%），那么定量值就是可信的。

把这条原则运用到公式（10）中，仪器的定量限（IQL）可用如下公式表示：
2.6 t
99S
LLMV
法
在两步法中的第二步包括计算MDL和MQL的值。

该方法在前面提到的美国环保局分析水样中曾介绍过。

该方法主要包括如下步骤：
1)称取七份或更多份的（粉碎并混匀）目标物基质的样品，每份样品的
重量基本相同。

2)用前面提到的任一方法估算LOQ的值，其值应是基质分析中的值，从
提取程序开始就要考虑浓度及稀释倍数等因素的影响。

3)向样品中加入目标物，使其浓度与估计定量限（the estimated limit
of quantification,ELOQ）在基质中的值基本相等。

4)用与样品相同的方法提取这些加标控制样品。

5)用与样品相同的方法检测最后的提取物。

6)计算出每一个加标样品的结果。

7)计算这些结果的标准偏差（S
ELOQ
）.
8)在99%置信水平上（t
99(n-1)
）用one-tailed t-statistic来确定n-1的值。

9)针对各种基质和不同提取程序，MDL可定义如下：
对七个重复加标样来说，t
99(n-1)
＝3.143。

正如前面提到的，定量限就是能产
生空白标准偏差大约10至12倍信号（在这个例子中是s
ELOQ
）所对应的浓度。

因
此，如果把LOQ设定为10倍的s
ELOQ
，对七个加标控制样(6度自由)来说，
t
99(n-1)
=10/3.143=3.182,这里可以取近似值3，那么针对基质与提取程序的方法定量限（MQL）可定义如下：
MQL＝3·MDL （15）
这将为我们提供一个相对准确定量的浓度限量。

为了计算ELOQ的值，在方法确证和样品分析过程中，加标控制样一同被提
取和分析，这些加标控制样的标准偏差（s
LLMV
）也能被用来计算该方法的MDL和
MQL的值，在后面的例子中，对公式（14）而言s
LLMV 可以代替s
ELOQ
的值。

在上面提到的两步法计算MDL和MQL中，有几个影响分析信号的因素要考虑，主要包括如下：
·仪器噪声
·仪器灵敏度的易变性
·方法的易变性
·基质的影响和干扰
但不管怎样，准确算出估计的LOD和LOQ是极其重要的。

在这种方法中加标控制样品的浓度对MDL和MQL的最后值有很大影响。

如果用来计算MDL的加标样的ELOQ值太高或太低，那么计算出的MDL和MQL的值与实际方法中得出的结果可能出入较大。

如果计算出的LOQ（MQL）的值与估算出的值显著不同，美国环保局建议，用上述列出的第一至第七步聚重新估算LOD/LOQ，并且要重新计算MDL和MQL，直到计算出的LOD和LOQ的值在估算出的范围内（LLMV的值等于2－5倍的MDL 的值）。

尽管这需要很多时间，但对准确计算出MDL和MQL的值十分重要。

但是，对一个有经验的化学家来说，如果通过以上任一方法能合适地确定ELOQ/LLMV，那么他们就能够较为准确地确定加标水平（LLMV）来计算MDL和MQL的值，从而避免无谓的重复劳动。

两步法是较为准确地确定方法检测限的方式。

虽然，我们接受国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）与美国化学学会（ACS）的k·s B/m定义，但它很难执行，它既没有考虑方法的易变性，也没有考虑基质的影响，但这点可以用不同浓度（与估算的LOD在同一数量级范围内）的加标控制样品的标准曲线来纠正。

一个较好的选择是用误差传递法来定义MDL，因为它同时考虑了s B和s i的值，为了准确地计算出s i和s m的值，要求至少做五条标准曲线。

3N p–p方法虽说简单，但有太多的东西需要分析者自己来判断，因此用该法获得的值很难在不同分析者及实验室间比较。

在两步法中，可用该法估算LOD 和LOQ的值。

·s ELOQ 两步法及RMSE法（或者3N p–p法）都可用来估算LOQ值。

t99(n
－1)
是针对提取程序来确定MDL和MQL最实际有用的方法，因为在最后的计算中它包含了基质影响与干扰，也包含了方法的易变性。

因为几种方法显然都可接受，所以在报出MDL和MQL的值时指明使用那种定义方法是很重要的。