免疫比浊法定量检测葡聚糖的研究

免疫比浊法定量检测葡聚糖的研究
柳颖;蚁细苗;林荣珍;曾练强;黄曾慰;马步;梁达奉
【摘要】葡聚糖影响甘蔗品质及制糖生产，主要表现在糖分损失、糖液粘度增加、过滤困难、结晶异常、糖产品适用性受限等，从而降低提糖率，增加制炼成本，影响糖产品质量。

本文对单克隆抗体比浊法测定葡聚糖的方法学进行研究，结果表明，该方法能快速准确测定糖厂蔗汁等在制品及产品中葡聚糖含量，线性范围10～500 mg/L，检测限为10 mg/L，加标回收率98%～102%，RSD<4%，灵敏度1.3 mg/L。

%Dextran causes marked harmful impact on sugarcane quality and sugar production, which leads to severe sugar loss, increased viscosity of the flow, elongated crystals, expensive yield loss and declined quality of sugar. Based on the newly-generated monoclonal antibody, a reliable immunoturbidimetric method for quantitative detection of dextran was developed. This article studied the proformance of the method, which was proved to be a rapid, correct and convenient tool for detecting dextran in raw material, by-products and end-products of sugar. Results showed that, the linearity was good in the range of 0.01~0.5 mg/mL; the sensitivity was 1.3 mg/L; RSD was less than 4%; the minimum detectability was 0.01
mg/mL; the standard addition recovery rate of the sugar samples were between 98%~102%.
【期刊名称】《甘蔗糖业》
【年(卷),期】2013(000)005
【总页数】4页(P52-55)
【关键词】葡聚糖;甘蔗品质;制糖;免疫比浊
【作者】柳颖;蚁细苗;林荣珍;曾练强;黄曾慰;马步;梁达奉
【作者单位】广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东
广州510316;广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东
广州510316;广西糖业研发中心，广西南宁530002;广州甘蔗糖业研究所广东省
甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316;广州甘蔗糖业研究所广东省
甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316;广西糖业研发中心，广西南
宁530002;广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广
州510316; 广西糖业研发中心，广西南宁530002
【正文语种】中文
【中图分类】TS241
0 前言
随着国内外糖品市场竞争的激烈化及品质意识的提升，越来越多的人意识到糖料甘蔗品质对制糖效率、成本以及产品质量的影响。

制糖工业中通常以一些利于高糖分收回的因素作为甘蔗品质评定的指标，蔗糖分高、纯度高、纤维素含量低、非糖分少的甘蔗被公认是品质好的甘蔗[1]。

这种衡量标准适用于新鲜、完整的甘蔗评定，但对于评定受微生物感染而变质的甘蔗来说并不完善。

糖料甘蔗在采收后由于微生物感染会产生新陈代谢产物如有机酸、乙醇、甘蔗葡聚糖、低聚糖、甘露醇等。

在南非，乙醇的积聚曾被作为甘蔗提取中糖分损失的指标以及由火烧收割到破碎提汁延误的指标，火烧蔗中的乙醇含量是非火烧蔗中的2～3 倍[2]，但后来证明乙醇不能作为衡量甘蔗变质的有用指标[3]。

甘露醇形成速率远高于协同产生的低聚糖或
者乙醇，被认为是甘蔗变质的一个可靠指标[3-5]。

但是以上几种因素所带来的危
害远远没有甘蔗葡聚糖的大。

甘蔗由于刀伤、压伤、病虫害等因素形成创口，在收割后放置期间，创口受到肠膜明串珠菌等微生物感染而形成葡聚糖。

伴随着甘蔗的机械化收割，蔗料刀口增多，收获、运输、压榨之间协调难度增加，使甘蔗葡聚糖的形成剧烈地增加，其带来的问题越来越凸显，所以不能简单地以蔗糖分、纯度等作为划分甘蔗品质好坏的指标，葡聚糖在甘蔗或者蔗汁中的含量成为衡量甘蔗品质的新指标。

葡聚糖的实时监测成为甘蔗制糖生产控制的一个重要技术。

葡聚糖的测定一般可用Haze/ICUMSA法[6]、Robert’s 铜法[7]、Potical Activity Ltd.DASA法[8]、酶解法等。

但这些方法都有较大的局限性，如准确度不高、操作繁琐等缺点。

本团队现已成功制备葡聚糖单克隆抗体，能与葡聚糖形成抗原-抗体（Ab-Ag）复合物而发生混浊，通过测定溶液浊度而计算得出葡聚糖含量。

该方法准确度高，前处理简单，5～10 min 即可得到结果，适用于甘蔗制糖过程原料、糖产品及在制品中的
葡聚糖检测，可实时监测糖厂生产过程的葡聚糖含量变化。

1 材料与方法
1.1 实验材料
α-葡聚糖T-2000 标准品，蔗汁及白砂糖样品若干，葡聚糖单克隆抗体检测试剂盒（广州甘蔗糖业研究所研制）。

1.2 主要仪器设备
MCA 浊度仪，移液枪，手持式锤度计，电子天平，滤纸。

1.3 测定步骤
常规指标的测定按《白砂糖》（GB317-2006）和《甘蔗制糖化学管理分析方法》进行，葡聚糖含量测定采用免疫比浊法。

1.3.1 样品前处理
液体样品以0.45 µm 滤膜过滤后备用，固体样品溶解至蔗糖浓度为50oBx 左右，以0.45 µm 滤膜过滤后备用。

1.3.2 抗体标定
取抗体冻干粉1 瓶，加入10 mL 抗体稀释液，摇匀后静置5 min，用0.45 µm 滤膜过滤后备用。

吸取1 mL 抗体，静置2 min，读取浊度值，记为N标0；加入10 µL 葡聚糖标准品（500 mg/L），用移液器吹打混匀，开始计时，读取2 min 时的浊度值，记为N标，则500 mg/L 葡聚糖标准品引起的浊度变化值为（N标－N标0）。

1.3.3 样品测定
吸取1 mL 抗体，静置2 min，读取浊度值，记为N0；加入10 µL 经过前处理的样品，用移液器吹打混匀，开始计时，读取2 min 时的浊度值，记为N1，则样品引起的浊度变化值为（N1－N0）。

1.3.4 结果计算
样品中葡聚糖含量（mg/kg）=（N1-N0）×500×稀释倍数/（N标-N标0）1.4 方法学考察
1.4.1 标准曲线及灵敏度[9]
在10.0 mL 容量瓶中配制浓度为800、600、500、250、100、50、25、12 mg/Lα-葡聚糖T-2000 标准溶液，以浓度及其对应的吸光度值作图，得标准曲线并计算回归方程及R2 值。

灵敏度是分析物浓度或量的微小变化所产生的分析信号的变化，其实质是标准曲线的斜率。

1.4.2 最低检出限
以蒸馏水为空白样品，重复测定5、10、20 mg/L标准品6 次，用t 检验统计测定数据与空白相比是否有显著性差异，确定有显著性差异的最小浓度。

1.4.3 重复性
重复测定500 mg/L 标品及原糖样品8 次，计算其相对标准偏差(RSD)值。

1.4.4 加标回收率
1.4.4.1 固体样品制备分别精密称取1.000 g 原糖样品，溶于1 mL 蒸馏水中，以
0.45 µm 膜过滤制得供试品溶液。

1.4.4.2 液体样品制备
分别吸取1.0 mL 蔗汁和糖蜜，以12000 r/min离心5 min，上清液以0.45 µm 膜过滤制得供试品溶液。

1.4.4.3 回收率试验
根据免疫比浊法平行测定2 次的结果，计算得各供试品溶液α-葡聚糖含量。

加入一定量葡聚糖标品的白砂糖样品，计算空白加标回收率；加入一定量葡聚糖标品的原糖、蔗汁、糖蜜样品，计算样品加标回收率。

计算公式：
2 结果与讨论
2.1 标准曲线及灵敏度（图1）
由图1 分析可知在浓度为500 mg/L 以下线性关系良好，线性回归方程为
y=0.0759x+0.7437，相关系数R2=0.9967，标准曲线的斜率为0.0759 NTU•(mg/L)-1，本试验所用浊度仪精度为0.1 NTU，则引起仪器读数变化的最小浓度为1.32 mg/L，因此可认为本方法的灵敏度为1.32 mg/L。

浓度为500 mg/L 以上时结果偏离线性，原因可能是抗体量不足。

本实验使用500 mg/L 以下线性关系良好部分为标准曲线。

结果见表1 及图1。

表1 葡聚糖T-2000 标准曲线
图1 T-2000 葡聚糖标准曲线
2.2 最低检测限
以蒸馏水为空白样品，重复测定5、10、20 mg/L标准品6 次，用t 检验统计测
定数据与空白相比是否有显著性差异，确定有显著性差异的最小浓度为10 mg/ L。

结果见表2。

表2 免疫比浊法测定葡聚糖标准品的最低检出限∆NTU
2.3 重复性
重复测定500 mg/L 葡聚糖标准品和1 份原糖样品各8 次，计算相对标准偏差(RSD)值分别为3.0%和3.7%。

结果见表3。

表3 免疫比浊法测定葡聚糖标准品及原糖样品的重复性
2.4 加标回收率
表4 为免疫比浊法样品加标回收实验结果。

由表4 得，免疫比浊法测定葡聚糖的加标回收率为98%～102%。

表4 免疫比浊法的样品加标回收实验
3 展望
甘蔗葡聚糖主要是在甘蔗变质期间形成，是甘蔗变质的直接产物。

葡聚糖的产生和存在均使蔗糖损失，葡聚糖的产生直接消耗蔗糖，产生的葡聚糖又明显增大糖液的粘度，降低糖液的过滤性，影响煮糖、结晶与分蜜。

严重时因葡聚糖形成而消耗蔗糖将导致每10000 t 甘蔗直接损失大约7 t 蔗糖。

因此，有必要重视甘蔗原料、在制品、成品中葡聚糖的测定及清除问题，降低生产成本，提高制炼效率、提高产品品质。

免疫比浊法适用范围广，可用于测定甘蔗中的葡聚糖来衡量甘蔗的新鲜度，还可用于测定不同制糖工艺所得的糖产品及在制品，如原糖、白砂糖、赤砂糖、蔗汁、糖蜜等。

该方法有显著性差异的最小浓度为10 mg/ L，线性范围为10～500 mg/L。

超出500 mg/L 后，免疫比浊法所得结果偏离线性回归线，因此在实际测定中，
应将样品稀释至葡聚糖含量为500 mg/L 以下，再进行免疫比浊分析。

免疫比浊
法具有样品前处理简单、测定时间短（10 min/样）、准确度高、测定条件简单的
优点。

参考文献
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mannitol[J].Sugar Journal,2005,68(1)：32.
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